1.1 水解類型

肽和蛋白質由通過肽鍵結合在一起的許多氨基酸組成。這些生物分子繼而構成許多不同的樣品，諸如生物治（zhi）療藥物、食品和飼料。為分析這些生物分子中所包含的氨基酸，使鍵水解以形成游離氨基酸至關重要。但在該過程中，偶聯(lián)氨基酸鍵的不同化學性質可能影響氨基酸鍵的裂解效率以及單個氨基酸的回收率。例如，水解過程中氨基酸的回收率會受到特定化學反應、試劑基質干擾物和氨基酸本身穩(wěn)定性的影響。

鑒于樣品和氨基酸的化學及物理性質存在很大差異，多年來已經(jīng)開發(fā)出不同的水解程序。這些程序因反應類型（化學或酶促反應）、化學反應的性質（酸或堿）和反應的物理狀態(tài)（液相或氣相）而異。這些差異會影響特定氨基酸（可能被特定試劑破壞）的回收率或水解所需的效率和時間。在一些情況下，可能需要采用多種水解程序以確定樣品的總氨基酸含量。常見的化學水解反應類型和水解模式如下所述。

注：酶水解是一種不常用的程序，本文檔未作介紹。

還需注意的是，許多化學水解反應可以使用不同類型的設備進行。過去，水解程序在真空下使用熱源以確保反應完成，但隨著更現(xiàn)代化的設備推出，微波誘導水解也得到了廣泛應用。每種方法的優(yōu)勢各不相同，應當在選擇設備之前加以考察。

1.1.1 酸水解

酸水解是水解蛋白質樣品的最常用方法，該方法可以在氣相或液相中進行。盡管該反應可以使用一系列不同的酸，但最常用的是6 M鹽酸。由于鹽酸具有蒸發(fā)性，也可以用于回收少量緩沖液中的水解產(chǎn)物，處理少量樣品時這一特性非常有用。此外，鹽酸的通用性使其可用于液相或氣相水解。

采用6 M鹽酸的酸水解反應導致向每個共價肽鍵中添加水，從而得到所需的單個氨基酸（圖1）。但是，并非所有氨基酸在鹽酸水解下都能完全回收。一些氨基酸會水解為酸形式：例如天冬酰胺和谷氨酰胺分別形成天冬氨酸和谷氨酸。此外，其他氨基酸無法得到可靠的測量。例如，色氨酸在反應過程中被破壞，而含硫氨基酸（例如，半胱氨酸、蛋氨酸）由于氨基酸被部分破壞而無法得到可靠的測量。此外，由于酸水解的性質，酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等氨基酸的回收率可能較低。

圖1.蛋白質的酸水解

但是，如果經(jīng)過預處理，一些含硫氨基酸（例如，半胱氨酸、蛋氨酸）可以在用鹽酸酸水解時得以保留。為準確定量分析這些氨基酸，可以在用鹽酸酸水解之前對樣品進行氧化或烷基化。對于氧化，在用鹽酸酸水解之前，通常用過甲酸將含硫氨基酸氧化。由此導致這些氨基酸的氧化形式得到準確定量。也可以通過烷基化保留含硫氨基酸（半胱氨酸），從而準確定量其烷基化形式。兩種最常用的烷基化試劑產(chǎn)生兩種形式的半胱氨酸，即吡啶乙基半胱氨酸或羧甲基半胱氨酸。這種烷基化過程的另一個優(yōu)勢在于它不影響其他氨基酸。

最后，鑒于利用鹽酸水解難以定量分析某些氨基酸，針對特定氨基酸可采用替代酸水解技術。一種技術使用磺酸（例如甲磺酸(MSA)）來定量分析色氨酸和蛋氨酸（呈亞砜的形式）。雖然這種試劑是非揮發(fā)性的，但它能夠保留色氨酸和蛋氨酸亞砜以進行定量。

1.1.2 堿水解

雖然用鹽酸酸水解是迄今為止十分常用的水解蛋白質和肽的技術，但色氨酸的測量通常使用堿水解。由于色氨酸在堿性條件下保持穩(wěn)定，因此該技術可準確定量色氨酸，并且廣泛用于從食品和飼料到肽和蛋白質的各種樣品。堿水解通常使用NaOH或KOH作為試劑。但是，堿水解不能代替酸水解來定量分析所有氨基酸。在堿性條件下，精氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸被破壞，無法定量。其他氨基酸也受到影響，因此堿水解通常僅用于色氨酸。

1.2 水解模式

水解反應在液相或氣相中進行。無論采用哪種水解模式，專門設計用于水解的儀器都將促進反應。過去，許多水解反應在高溫和真空下進行數(shù)小時至數(shù)天，但是隨著微波水解儀器的出現(xiàn)，相同的過程在較低溫度下只需數(shù)分鐘即可完成。

1.2.1 液相水解

在液相水解中，樣品和鹽酸都直接加入水解管中進行反應。該程序需要將樣品、內(nèi)標和酸直接加入水解管中。將水解管用氮氣沖洗，然后密封并在完成水解所需的時間內(nèi)持續(xù)加熱。液相水解可能需要數(shù)小時到數(shù)天才能完成。該程序通常用于較復雜的樣品。

1.2.2 氣相水解

在氣相水解中，樣品僅與氣相鹽酸發(fā)生反應。該程序需要將樣品和內(nèi)標（如果使用）放入水解管中。然后將樣品干燥，并將每個試管敞開放入水解容器中。將酸（6 M鹽酸）加入裝有水解管的容器底部，然后將容器密封并抽真空，再用氮氣沖洗。在完成水解所需的時間內(nèi)持續(xù)加熱容器。該模式減少了來自任何不純試劑（例如鹽酸）的污染。氣相水解通常以快于液相水解的速率發(fā)生。在氣相水解中，通常需要樣品具有高純度。

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