基爾頓生物科技（上海）有限公司 

JRDUN Biotechnology(Shanghai)Co.,Ltd

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HE染色實驗報告

前言

HE染色法，即是蘇木精-伊紅染色法。石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中基本、使用廣泛的技術(shù)方法。

易于被堿性或酸性染料著色的性質(zhì)稱為嗜堿性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia )；而對堿性染料和酸性染料親和力都比較弱的現(xiàn)象稱為中性（neutrophilia)。組織內(nèi)的蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的種類很多，它們有不同的等電點。在普通染色法中，染色液的酸堿度為pH6左右，細(xì)胞內(nèi)的酸性物質(zhì)如細(xì)胞核的染色質(zhì)、腺細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及透明軟骨基質(zhì)等均被堿性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜堿性。而細(xì)胞質(zhì)中的其它蛋白質(zhì)如紅細(xì)胞中的血紅蛋白、嗜酸粒細(xì)胞的顆粒及膠原纖維和肌纖維等被酸性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜酸型。如果改??染色液的酸堿度，pH值升高時，則原來被酸性染料染色的物質(zhì)可變?yōu)槭葔A性；pH值降低時，原來被堿性染料染色的物質(zhì)則可變?yōu)槭人嵝?。所以說染色液的pH值可以影響染色的反應(yīng)。

脫氧核糖核酸（DNA）兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽離子結(jié)合使胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明對比。伊紅是細(xì)胞漿的良好染料。

由于組織或細(xì)胞的不同成分對蘇木精的親和力不同及染色性質(zhì)不一樣。經(jīng)蘇木精染色后，細(xì)胞核及鈣鹽粘液等呈藍(lán)色，可用鹽酸酒精分化和弱堿性溶液顯藍(lán)，如處理適宜，可使細(xì)胞核著清楚的深藍(lán)色，胞漿等其它成分脫色。再利用胞漿染料伊紅染胞漿，使胞漿的各種不同成分又呈現(xiàn)出深淺不同的粉紅色。故各種組織或細(xì)胞成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點均可顯示出來。

染色結(jié)果：細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，粘液呈灰藍(lán)色。細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。

圖1 HE染色結(jié)果示意圖

材料與方法

1.1 主要試劑

試劑名稱	廠家	貨號
石蠟	上海國藥集團(tuán)	69018961
甲醛	上海國藥集團(tuán)	10010018
二甲苯	上海國藥集團(tuán)	10023418
無水乙醇	上海國藥集團(tuán)	10092680
氨水	上海國藥集團(tuán)	10002118
蘇木素	BASO	714094
伊紅	BASO	BA4099
中性樹脂	上海長島生物技術(shù)有限公司	G8590

1.2 主要儀器及耗材

儀器名稱	廠家	型號
正置顯微鏡	OLYMPUS公司	CX41
移液器	吉爾森P型移液器公司	P2、P10、P20、P100、P200、P1000
恒溫烘箱	上海恒一科學(xué)儀器有限公司	DHG-9023A
石蠟切片機(jī)	徠克公司	SQ2125
攤片機(jī)	徠克公司	PPTHK-21B
IMS圖象分析系統(tǒng)	基爾頓生物科技（上海）有限公司
數(shù)碼相機(jī)	NIKON公司	D5100

2方法

2.1樣本包埋與固定

2.1.1取材和固定

切取組織時應(yīng)使用鋒利的刀、剪，切取組織塊時，從刀的根部開始向后拉動切開組織。組織塊的厚度約為0.2~0.3cm，大小為1.5cm×1.5cm x 0.3cm為宜。取好的組織塊置于10%福爾馬林中固定48小時；

2.1.2洗滌與脫水

將固定后的組織用流水沖洗，去除殘留的固定液和雜質(zhì)。不同濃度的乙醇逐級脫水，50%、70%、85%、95%直至純酒精（無水乙醇），每級2小時。脫水在有蓋的瓶中進(jìn)行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期保存，可加入等量的甘油。

2.1.3透明

將組織塊置入純乙醇和二甲苯的等體積混合液中2小時，再進(jìn)入純二甲苯兩小時，再一次純二甲苯兩小時；材料經(jīng)過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態(tài)。

2.1.4浸蠟

浸蠟須在恒溫箱中進(jìn)行。先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時，再先后移入2個熔化的石蠟液中浸漬各3小時左右；

2.1.5包埋

包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準(zhǔn)備好紙盒，將熔蠟倒入盒內(nèi)，迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⒓埡邪慈胨?，使其迅速冷卻凝固，30min后取出。

2.1.6切片

切片前將蠟塊在-20度冰箱中至少放置30min，以增加硬度。將切片刀裝在刀片機(jī)的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。調(diào)整切片機(jī)上的切片厚度為4-7μm，然后切片。

2.2  HE染色

2.2.1烤片和脫蠟

將玻片置于65℃恒溫烘箱中烤片30min；置于二甲苯I中浸泡15min，再置于二甲苯II 中浸泡15min。 

2.2.2水化

將脫蠟后的切片經(jīng)酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精分別浸泡5min，自來水沖洗10min。

2.2.3蘇木素染色

將已入蒸餾水后的切片放入蘇木素水溶液中染色5min，氨水中分色，數(shù)秒鐘。流水沖洗15min，入70％和90％酒精中脫水各10min。

2.2.4伊紅染色

入酒精伊紅染色液染色1-2min，染色后的切片經(jīng)純酒精脫水。

2.2.5透明和封片 

將玻片置于二甲苯中透明3min×2次，中性樹膠封片，放入65℃烘箱中15min。

2.3 圖像采集和分析

通過顯微鏡拍照，采集分析樣本相關(guān)部位。