峰拖尾是較常見(jiàn)的色譜峰形失真。我們想要解決這些失真問(wèn)題，需要先讓我們了解導(dǎo)致峰拖尾的原因。

當(dāng)峰不對(duì)稱(chēng)因子 (As) 大于1.2時(shí)會(huì)出現(xiàn)峰拖尾——盡管As大于1.5的峰對(duì)于許多測(cè)定是可以接受的。這是使用以下等式確定的：

As=B/A; 其中B=峰中心后10%峰高處的峰寬；A=峰中心前基線處的峰寬，

峰拖尾的主要原因是出現(xiàn)了不止一種分析物保留機(jī)制。在反相分離中，分析物保留通常是通過(guò)與固定相的非特異性疏水相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而，與駐留在二氧化硅載體表面上的任何電離殘留硅烷醇基團(tuán)的極性相互作用也很常見(jiàn)。具有胺和其他堿性官能團(tuán)的化合物與此類(lèi)離子化的硅烷醇基團(tuán)強(qiáng)烈相互作用，產(chǎn)生拖尾峰。下圖顯示了流動(dòng)相pH>3.0時(shí)的情況。

二次分析物與硅膠表面上的離子化硅醇相互作用會(huì)導(dǎo)致峰拖尾。需要盡量減少這些相互作用以獲得可接受的峰形。

如何避免峰拖尾

有幾種方法可用于避免峰拖尾：

?     在較低的 pH 值下運(yùn)行

?     使用高度去活的色譜柱

?  考慮質(zhì)量過(guò)載的可能性

?  考慮柱床變形的可能性

?  分析堿性化合物時(shí)在高 pH 值下工作

?     使用樣品凈化程序

在較低的pH值下運(yùn)行

由于硅烷醇基團(tuán)是酸性的，通過(guò)在較低的pH值下進(jìn)行色譜分離，可以較大限度地減少二次相互作用，從而確保這些可電離的殘留硅烷醇基團(tuán)的完全質(zhì)子化。

當(dāng)然，這可能會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間縮短，因?yàn)闃悠分写嬖诳呻婋x的堿性分析物，然后可能需要通過(guò)減少流動(dòng)相中有機(jī)改性劑的含量來(lái)緩解這種情況。不應(yīng)在pH 3下使用標(biāo)準(zhǔn)硅膠，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致硅膠溶解。 Agilent ZORBAX Stable Bond (SB) 色譜柱設(shè)計(jì)用于在低 pH (<3) 下運(yùn)行。

下面色譜圖中堿性 藥 物化合物的五種組分混合物分別由苯丙醇胺、麻黃 堿、苯丙 胺、甲基 ***和苯 丁胺（峰 1-5）組成。

第1張色譜圖是在流動(dòng)相 pH 值為 7.0 時(shí)獲得的。在這些分離條件下，峰4甲基苯 丙胺的As 為2.35。降低流動(dòng)相pH值可減少堿性分析物與殘留硅烷醇基團(tuán)的相互作用，從而消除過(guò)度的峰拖尾。第2個(gè)色譜圖是在流動(dòng)相pH值為 3.0時(shí)獲得的，在這些分離條件下將甲基***的As降低到1.33。

使用高度去活的色譜柱

或者，可以使用“封端柱”。封端是一個(gè)過(guò)程，其中殘留的硅烷醇基團(tuán)被處理以將它們轉(zhuǎn)化為極性顯著較低的表面官能團(tuán)。這具有減少它們可能與極性分析物分子發(fā)生的次級(jí)相互作用量的效果。

封端過(guò)程中通常使用的化學(xué)試劑包括：

? 三 甲基氯硅烷 (TMCS)

? 六甲基二硅氮烷 (HMDS)

封端通過(guò)有效阻斷極性分析物與潛在可電離殘留硅烷醇基團(tuán)的相互作用，減少了極性分析物的峰拖尾。然而，封端僅使未反應(yīng)的殘余硅烷醇基團(tuán)的數(shù)量進(jìn)一步減少約 50%。 由于空間位阻因素，這種反應(yīng)在絕 對(duì)值方面很少非常有效，因此“完全封端”的色譜柱并不像看起來(lái)那樣！

Agilent ZORBAX Eclipse Plus 色譜柱 采用高度封端、去活，是方法開(kāi)發(fā)或一般實(shí)驗(yàn)室使用的絕好的選擇。即使是酸性、堿性和高極性分析物，它們也能產(chǎn)生對(duì)稱(chēng)的峰形

考慮質(zhì)量過(guò)載的可能性

如果所有色譜峰都拖尾，則考慮色譜柱質(zhì)量過(guò)載的可能性。通過(guò)簡(jiǎn)單地稀釋樣品 x10 并重新評(píng)估所得色譜圖中的峰形來(lái)評(píng)估這一點(diǎn)。如有必要，使用更高容量的固定相（即增加碳百分比或孔徑），使用直徑更大的色譜柱，或減少絕 對(duì)樣品量或進(jìn)樣體積

考慮柱床變形的可能性

評(píng)估色譜柱以確定色譜柱空隙的形成或入口篩板部分堵塞是否是根本原因。 更換色譜柱將很快確認(rèn)問(wèn)題。 如果懷疑有空隙，請(qǐng)反轉(zhuǎn)色譜柱，將其與檢測(cè)器斷開(kāi)連接，并在 100% 強(qiáng)溶劑（至少 10 倍柱體積）中洗滌。 這將清洗色譜柱入口過(guò)濾器中的任何阻塞污染物，直接進(jìn)入廢液。 檢查制造商的說(shuō)明以了解色譜柱是否應(yīng)保持反向流動(dòng)方向。 通過(guò)定期更換溶劑過(guò)濾器、使用在線過(guò)濾器和保護(hù)柱，可以避免色譜柱濾芯的堵塞。 可以使用以下鏈接找到有關(guān)這些部件的更多信息。

?  溶劑和在線過(guò)濾器

?  保護(hù)柱

分析堿性化合物時(shí)在高 pH 值下工作

從實(shí)用的角度來(lái)看，通常只能使用 pH 值來(lái)抑制酸離子化，因?yàn)閴A離子化通常需要大于8的 pH值，在該pH值下二氧化硅會(huì)發(fā)生溶解。然而，安捷倫 ZORBAX Extend HPLC 色譜柱能夠在更寬的pH值條件下運(yùn)行，通過(guò)使用雙齒和三齒配體保護(hù)硅膠表面免于溶解。這些配體是雙齒的，并在它們應(yīng)用于固定相之前使用專(zhuān)有化學(xué)進(jìn)行橋連。它們的橋接結(jié)構(gòu)提供了防止二氧化硅表面水解的空間保護(hù)。

Agilent ZORBAX Extend HPLC 色譜柱的雙齒配體

干擾化合物的可能出現(xiàn)是不應(yīng)忽略峰拖尾的主要原因。 通過(guò)改變檢測(cè)波長(zhǎng)來(lái)確認(rèn)干擾物的存在，或通過(guò)使用效率更高的色譜柱（即更長(zhǎng)的色譜柱或填充更小的顆粒的色譜柱）來(lái)提高分離的分辨率。 安捷倫 ZORBAX RRHT 和 RRHD 色譜柱旨在提供非常高效的分離，可用于分離共流出峰。

使用樣品凈化程序

固相萃取 (SPE) 可用于去除任何干擾污染物。

而且...不再有峰拖尾