高效液相色譜法（HPLC）因其定量分析結果準確、分析周期短、分析范圍廣、分析檢出限低等優(yōu)點，近年來得到了迅速發(fā)展，幾乎可以應用于所有大分子有機物的分析。

可以預見，高效液相色譜儀器的應用將在農業(yè)、輕、重、海、陸、空、食、衣、用等各個領域無處不在，無處不在。但是，如何用好高效液相色譜柱是一個非常關鍵的問題。

1、高效液相色譜柱及柱外相關問題
1）色譜峰拖尾：與色譜柱、流動相流速、樣品等有關，必須從這些方面找出拖尾的原因。
2）如何延長色譜柱的壽命：維護很重要。長期不使用時，用甲醇浸泡。嚴格控制洗柱時間或洗柱溶劑的體積。一般應使用甲醇（或水：甲醇為20：80）洗滌45分鐘或床體積的20倍。
3）必須注意控制“柱外效應”。所謂“柱外效應”，是指在 HPLC 系統(tǒng)中，由于管子、連接件、進樣器、流通池以及柱系統(tǒng)的死體積所引起的色譜峰展寬效應。
4）進樣：自動進樣時，應經常對自動進樣器進行檢測，要求儀器進樣器穩(wěn)定可靠；手工采樣時，要特別注意采樣的細節(jié)和感覺。

2、高效液相色譜柱質量
1）色譜柱的柱效：塔板數越高越好，要特別注意影響柱效的因素。塔板數下降到一定程度時報廢。
2）重復性：當色譜柱重復使用時，zui大RSD可保持在0.1%以下。
3）耐久性（壽命）：因為柱效容易降低，所以要注意柱子保護。
4）色譜柱使用后必須清洗干凈，以免腐蝕、堵塞、減少塔板數。一般應以床體積的20倍沖洗。 對于每隔幾天使用的HPLC，應先用20%甲醇：80%水洗30分鐘左右，然后再用純甲醇洗20分鐘后保存。

3、流動相問題
1）pH值特別重要：一般C18柱的pH值小于3時，很容易損壞色譜柱，但小的pH值可用于耐酸柱。
2）請注意試劑截止波長的選擇：如乙腈截止波長215nm、丙酮截止波長330nm、正丁烷210nm等。
3）流速：流速要合適，否則會影響峰形，浪費溶劑。一般常規(guī)分析通常選擇1ml/min。

4、溶劑預處理 zui好使用HPLC級的溶劑，使用前必須過濾脫氣。請注意以下事項：

1）過濾目的： 溶劑進泵前和進樣前應過濾除去溶劑中的微小顆粒和微生物，以保證泵和色譜柱不會堵塞或損壞，分析數據要可靠。
2）對過濾器的要求及zui大孔徑的選擇方法： 對過濾器的一般要求：速度快、溶解速度小、死體積小、孔徑精 確、體積合適、化學相容性好等。

對于孔徑選擇方法：如果柱填料直徑小于3μm或無菌過濾，一般選擇0.2μm孔徑；如果柱填料直徑大于5μm，選擇0.45μm；如果是預過濾或過濾困難的樣品，一般選擇1μm孔徑。 尤其是用無機鹽配制的緩沖液，更要注意選擇合適的過濾器。否則，不可能得到可靠的分析和測試數據。

3）脫氣：
主要目的是去除溶解在流動相中或混合產生的氣泡。液相色譜中zui常用的流動相脫氣是離線超聲振動脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。進入液相泵的流動相中的氣泡會引起壓力波動，這是非常有害的，必須消除?？梢源蜷_排水閥以高流速沖洗。

5、緩沖溶液
1） 緩沖液在使用前必須過濾。
2）溶劑和樣品容易滋生**和霉菌，因此請對其進行清潔。
3）一般有機溶劑不能直接用于清洗和洗滌。
4）梯度洗脫時，選擇吸光值低的緩沖液，例如：梯度洗脫時，緩沖液與相應的有機物預混以防止鹽析。在峰不拖尾的情況下，盡量使用低濃度的緩沖鹽，防止鹽析；緩沖鹽濃度一般在20～30mm左右。

如果流動相中有機相含量較高，則流動相中緩沖鹽的濃度不能太高，鹽濃度至少要保證在流動相條件下不會沉淀。離子對緩沖液的濃度要高一些，一般為50-100mm。

6、噴油器的清潔 對于注射器或注射針，請注意三點：
1）對進樣器的要求：自動進樣，進樣速度快，有的儀器進樣只需17秒。
2）采樣室要求可控：一般采用Peltier冷卻，溫度控制范圍為4℃-100℃。
3）要特別注意注射殘留物的清潔（主要是清潔針頭）。