使用方法:
一、樣品 RNA 的制備
1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意：可以選用本公司生產(chǎn)的一管式病毒 RNAout
2、或柱式病毒 RNAout。
二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA
1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系（20 μL 體系）
2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。
3. 嚴(yán)格按順序加入 6μL RT Buffer（含 dNTP）和 2μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），
反應(yīng)終體積為 20μL。
4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。
5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，丌需要純化。
訂購信息：
產(chǎn)品名稱：豬藍(lán)耳病病毒PCR方法
英文名稱：詳見說明
貨號：BJ-01R4787
產(chǎn)品規(guī)格：50T
運(yùn)輸：低溫
保存：負(fù)20度
有效期：一年
貨期：現(xiàn)貨
【儲存條件及有效期】:
-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個月。
【適用儀器】:
ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。
【樣本采集、存放及運(yùn)輸】：
u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；
u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）；
u 運(yùn)輸：采用**或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
本公司產(chǎn)品僅用于科研。
【自備試劑】:
核酸提取試劑，如QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。
組成及試劑配制:
1、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
1）RT-PCR可以檢測組織、細(xì)胞、血液、等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗(yàn)前請充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；
2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號；
3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。
4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。
實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括量和相對定量）和定性分析。
主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。
主要技術(shù)：引物設(shè)計(jì)、RNA提取、cDNA合成、qPCR。
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。
(2) 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的**量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位)；在學(xué)中zui小檢出率為3個。
(3) 簡便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
(4) 對標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。
5-fluoro 203 10mM*1mLinDMSO MSDC-0160 250mg
MK-0591 5mg Capsazepine 10mg
(±)8(9)-EET methyl ester 100mg (±)-JWH 018 N-(4-hydroxypentyl) metabolite 50mg
TGFB3 (207 a.a.) Human 100mg 3-methoxy Limaprost 5mg
Amidepsine A 10μg Etravirine-d6 10mg
1-Stearoyl-2-15(S)-HpETE-sn-glycero-3-PC 25mg MK-4074 1mg
H-Chg-OH 5mg Sofosbuvir impurity G 1mg
Minocycline HCl 5mg Tectochrysin (Techtochrysin) 10μg
1-1(Z)-Hexadecenyl-2-Palmitoyl-sn-glycero-3-PC 2500μg IDO inhibitor 1 10mg
GNE 220 10mg Fmoc-Leu-Thr(Psi(Me,Me)pro)-OH 50mg
Calpain Inhibitor II 25mg MRT67307 1mg
Amastatin (hydrochloride) 100mg BIX 02188 25mg
HMGB2 Human 1g KW 2449 50mg
CPI-268456 1mg IL17F Human 10mg
HCV NS3, Biotin 2μg ADU-S100 enantiomer Ammonium salt 2.5mg
豬藍(lán)耳病病毒PCR方法MK-8353(SCH900353） MK-8353 (SCH900353) 是一種有效的，選擇性的，可口服的 ERK1/2 抑制劑，IC50 值分別為 23.0 nM 和 8.8 nM；MK-83
IWP-O1 IWP-O1 是一個有效的Porcn 抑制劑，其在L-Wnt-STF 細(xì)胞中測得的 EC50 值為 80 pM。能夠抑制HeLa細(xì)胞中Dvl2/3和LRP6的磷
(-)-Blebbistatin (-)-Blebbistatin是布雷他汀的S對映體。Blebbistatin是有效且選擇性的 myosin II 抑制劑，IC50 范圍為0.5至5 μM。
4EGI-1 4EGI-1 是一種 eIF4E/eIF4G 相互作用抑制劑，抑制 eIF4E 結(jié)合，Kd 值為 25 μM。
6H05 6H05是突變型原癌基因K-ras(G12C)選擇性變構(gòu)抑制劑。
A-205804 A-205804是一種強(qiáng)有效和選擇性E-selectin和ICAM-1表達(dá)抑制劑， IC50分別為20 nM和25 nM。
A66 A66 是一種高特異性的選擇性的 p110α 抑制劑，IC50 為 32 nM。
A-674563 A-674563是有效，選擇性的 Akt1 抑制劑，Ki為11 nM。
A-740003 A-740003 是一種有效的，選擇性的，競爭性的 P2X7 receptor 拮抗劑，抑制大鼠和人的 P2X7 受體，IC50 值分別為 18 和 40 nM
A-966492 A-966492 是一種新穎的，有效的 PARP1 和 PARP2 抑制劑，Ki 值為 1 nM 和 1.5 nM。
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