使用方法:

一、樣品 RNA 的制備

1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意：可以選用本公司生產(chǎn)的一管式病毒 RNAout

2、或柱式病毒 RNAout。

二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA

1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系（20 μL 體系）

2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。

3. 嚴(yán)格按順序加入 6μL RT Buffer（含 dNTP）和 2μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），

反應(yīng)終體積為 20μL。

4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，丌需要純化。

訂購(gòu)信息：

產(chǎn)品名稱：活動(dòng)錐蟲(chóng)熒光-PCR法

英文名稱：Trypanosoma vivaxPCR
貨號(hào)：BJ-01R4327

產(chǎn)品規(guī)格：50T

運(yùn)輸：低溫

保存：負(fù)20度

有效期：一年

貨期：現(xiàn)貨

【儲(chǔ)存條件及有效期】:

-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個(gè)月。

【適用儀器】:

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【樣本采集、存放及運(yùn)輸】：

u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)72h，-70℃以下可長(zhǎng)期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）；

u 運(yùn)輸：采用**或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

本公司產(chǎn)品僅用于科研。

【自備試劑】:

核酸提取試劑，如QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。

組成及試劑配制:

1、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

1）RT-PCR可以檢測(cè)組織、細(xì)胞、血液、等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號(hào)；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括量和相對(duì)定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計(jì)、RNA提取、cDNA合成、qPCR。

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對(duì)原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

(2) 靈敏度高

PCR產(chǎn)物的**量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)。

(3) 簡(jiǎn)便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。

(4) 對(duì)標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。

Human phospholamban,PLN ELISA Kit  人受磷蛋白 96T

Human tumour necrosis factor related weak inducer of apoptosis,TWEAK ELISA Kit  人腫瘤壞死因子相關(guān)弱凋亡誘導(dǎo)因子 96T

Human IPO-38 ELISA Kit  人IPO-38蛋白 96T

human excision repair cross-complementation group 1,ERCC1 ELISA kit  人切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1 96T

Human Protein Carbonyl,PC ELISA Kit   人羰基化蛋白 96T

human phospho-inhibitory subunit of NF-KapB Alpha,pIKB Alpha ELISA kit  人磷酸化核因子κB抑制蛋白α（IKKα human ELISA kit） 96T

Human paxillin,Pax ELISA Kit  人樁蛋白 96T

Human small breast epithelial mucin,SBEM ELISA Kit  人小乳腺表皮粘蛋白 96T

human Mus musculus similar to 60S ribosomal protein L12,LOC382344 ELISA kit   人類似60S核糖體蛋白L21 96T

human orosomucoid 2,ORM2 ELISA Kit  人類粘蛋白2 96T

活動(dòng)錐蟲(chóng)熒光-PCR法LDN-192960 hydrochloride  10mg  LY-411575  10μg    

NHPI-PEG2-C2-Pfp ester  10mg  Fmoc-Arg(Pbf)-OH  50mg    

Y-27632  100mg  5(S)-HpEPE  500μg    

ADAM10 Human, Sf9  100mg  OG-L002  1g    

E3 ligase Ligand 2  25mg  Nicodicosapent  5mg    

BRD9539  1g  INT-777  1g    

PF 4800567 hydrochloride  10mg  Moenomycin Complex  5mg    

Decanoic Acid-d2  1mg  IL 8 Rhesus Macaque  5mg    

DBIBB  20μg  1-Arachidonoyl Glycerol  50mg    

N-Methylnicotinamide  1mg  3-O-Acetylbufotalin  10mg    

Atipamezole (MPV 1248)  20mg  Ornithine Aminotransferase Human  2μg    

ErbB3 Mouse  10mg  AKR7A2 Human  10mM(in1mLDMSO)    

IVD Human  500mg  VAV1 Human  250mg    

10-PAHSA 13C4  250mg  EOGT Mouse  10mM(in1mLDMSO)    

Zika Envelope  5mg  Borrelia Afzelii p100  5mg    

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