使用方法:

一、樣品 RNA 的制備

1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意：可以選用本公司生產(chǎn)的一管式病毒 RNAout

2、或柱式病毒 RNAout。

二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA

1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系（20 μL 體系）

2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。

3. 嚴(yán)格按順序加入 6μL RT Buffer（含 dNTP）和 2μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），

反應(yīng)終體積為 20μL。

4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，丌需要純化。

訂購信息：

產(chǎn)品名稱：多殺巴斯德菌熒光-PCR法

英文名稱：Pasteurella multocidaPCR
貨號：BJ-01R4003

產(chǎn)品規(guī)格：50T

運輸：低溫

保存：負(fù)20度

有效期：一年

貨期：現(xiàn)貨

【儲存條件及有效期】:

-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個月。

【適用儀器】:

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定??PCR儀。

【樣本采集、存放及運輸】：

u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）；

u 運輸：采用**或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運輸。

本公司產(chǎn)品僅用于科研。

【自備試劑】:

核酸提取試劑，如QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。

組成及試劑配制:

1、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

實驗注意事項：

1）RT-PCR可以檢測組織、細(xì)胞、血液、等很多材料，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認(rèn)實驗方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計的引物來指示擴(kuò)增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括量和相對定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

(2) 靈敏度高

PCR產(chǎn)物的**量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位)；在學(xué)中zui小檢出率為3個。

(3) 簡便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

(4) 對標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。

Pyr-Gly-OH  20μg  GCSF Rat  10mg    

MAO B Human  10mM*1mLinDMSO  MAFG Human  5mg    

N-1-Boc-1,3-diaminopropane . HCl  25mg  IL 3 Dog  25g    

Tirzepatide hydrochloride  10mM(in1mLDMSO)  H-Glu(OBzl)-OBzl.HCl  5mg    

SERPINC1 Human, Sf9  1g  4,6-O-Benzylidene-D-glucose  1μg    

Histone H3K9Me3 (3-17) (human, mouse, rat, porcine, bovine) (trifluoroacetate salt)  10mg  ADHP (10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)  10mM(in1mLDMSO)    

GLRX1 Yeast  1mg  9(Z),11(E),13(Z)-Octadecatrienoic Acid methyl ester  100mg    

H3N2 Brisbane  10mM*1mLinDMSO  PPA1 Human  1mg    

HAO1 Human  50mg  CHIKV Mutant  100mg    

Boc-D-Orn(Boc)-OH  100μg  TDG Human  ?5mg    

ANGPTL3 Human, HEK  5μg  FR122047 (hydrate)  1mg    

GDC-0152  0.5mg  F 16915  10mg    

Sodium Ionophore VI  5mg  VRT752271  500μg    

Boc-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-OH  100mg  Secretin Human  100μg    

H-Ser-Ala-OH  50mg  Carbazeran  2μg    

多殺巴斯德菌熒光-PCR法桑色素 英文名稱Morin 含量：≥90% 20mg/支 phospho-NFKB p65(Ser529)  磷酸化細(xì)胞核因子抗體規(guī)格: 0.1ml

瑟丹酸內(nèi)酯 英文名稱Sedanolide 含量：≥97% 20mg/支 phospho-NFKB p65(Thr435)  磷酸化細(xì)胞核因子抗體規(guī)格: 0.1ml

山姜素 英文名稱Alpinetin 含量：≥98% 20mg/支 phospho-NFKB p65(Thr254)  磷酸化細(xì)胞核因子抗體規(guī)格: 0.1ml

山奈酚 英文名稱Kaempferol 含量：≥98% 20mg/支 phospho-NFKB p65(Thr505)  磷酸化細(xì)胞核因子抗體規(guī)格: 0.1ml

山奈酚葡萄糖醛酸苷 英文名稱Kaempferol-？-O-glucuronide 含量：≥98% 20mg/支 SULT2A1  膽鹽磺基轉(zhuǎn)移酶規(guī)格: 0.1ml

山奈苷 英文名稱KAEMPFEROL-3,7-DIRHAMNOSIDE 含量：95% 20mg/支 p53R2/RRM2B  核苷酸還原酶M2B抗體規(guī)格: 0.1ml

山梔苷甲酯 英文名稱shanzhiside methyl ester 含量：97% 20mg/支 NF66/alpha Internexin  α-中連蛋白抗體規(guī)格: 0.2ml

山茱萸新苷/山茱萸裂苷 英文名稱Cornuside 含量：90% 20mg/支 NF-L/Neurofilament L/Neurofilament 68  低分子量神經(jīng)絲蛋白抗體規(guī)格: 0.2ml

商陸皂苷甲 英文名稱Esculentoside A 含量：≥98% 20mg/支 NF-M/Neurofilament M  中分子量神經(jīng)絲蛋白抗體規(guī)格: 0.1ml

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