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技術(shù)文章

PCR反應(yīng)的特點有什么？
PCR反應(yīng)的特點：
一、特異性高
首 次報導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段，同時引物是在37℃延伸（聚合）易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時不被滅活，不必在每次循環(huán)擴(kuò)增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴(kuò)增的DNA序列與原模板DNA一致。擴(kuò)增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。

二、高度敏感
理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上，實際應(yīng)用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴(kuò)增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測。

三、快速及無放射性
一般在2小時內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴(kuò)增，加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細(xì)胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴(kuò)增檢測，省去費時繁雜的提純程序，擴(kuò)增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易于推廣。

四、簡便
擴(kuò)增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進(jìn)行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個內(nèi)切酶位點，擴(kuò)增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點的載體中。

五、可擴(kuò)增RNA或cDNA
先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經(jīng)PCR擴(kuò)增1ng有242堿基對長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴(kuò)增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對外顯子的擴(kuò)增并進(jìn)行序列分析。




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