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技術(shù)文章

PCR引物設(shè)計(jì)原則陳述
一、引物設(shè)計(jì)有3 條基本原則：
首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)；
其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；
再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。
PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。

二、引物設(shè)計(jì)原則：
1、引物長(zhǎng)度：18-26bp，可放寬至18-30bp（有研究表明超過(guò)30bp再增加引物長(zhǎng)度意義不大）；
2、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC 隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3、引物Tm：54-58℃，可放寬至52～62℃，GC%>60%可進(jìn)一步放寬；
4、擴(kuò)增子Tm：>92℃；
5、3'端：優(yōu)選三聯(lián)體WSS、SWS、TTS，二連體GC，單體S，盡量規(guī)避WWW、CGW、GGG、CG；
6、引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；
7、末端2bp 為GC；
8、引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等；
9、其他：避免3'端8bp及以上序列與模板多位點(diǎn)互補(bǔ)，盡量避免上下游3'端4bp及以上反向互補(bǔ)，盡量避免內(nèi)部回文。