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皮質(zhì)醇試劑盒測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程介紹
皮質(zhì)醇試劑盒測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程:
1、文庫(kù)制備:根據(jù)樣品的種類(lèi)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,將基因組DNA/cDNA段化處理至400-800bp間,經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA(sstDNA);
2、Emulsion PCR:特定比例的單鏈DNA文庫(kù)被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上,使大部分磁珠磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA斷。磁珠結(jié)合的文庫(kù)被擴(kuò)增試劑乳化,形成油包水的混合物,每個(gè)獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增,而不受其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬(wàn)個(gè)相同的拷貝。隨后,乳液混合物被打破,擴(kuò)增后仍結(jié)合在磁珠上的段既可被回收純化用于后續(xù)的測(cè)序?qū)嶒?yàn);
3、測(cè)序反應(yīng):攜帶DNA的珠子與其他反應(yīng)物混合物,隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測(cè)序。PTP孔的直徑(29um)只能容納一個(gè)珠子(20um)。然后將PTP板放置在GS FLX中,測(cè)序開(kāi)始。每一個(gè)與模板鏈互補(bǔ)的核苷酸的添加都會(huì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的信號(hào),并被CCD照相機(jī)所捕獲;
4、數(shù)據(jù)分析:GS FLX系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬(wàn)個(gè)讀長(zhǎng),讀取超過(guò)4-6億個(gè)堿基信息,通過(guò)GS FLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
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