細(xì)胞提取液反復(fù)凍融方法：

1、 吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細(xì)胞沖洗干凈。懸浮細(xì)胞可以省略該步驟。

2、 將細(xì)胞懸浮液收集到離心管中，在2-8℃下以1000×g離心5分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次。

3、 加入適量的預(yù)冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。在6孔培養(yǎng)板（約1×106個(gè)細(xì)胞）中，每個(gè)孔加入150-250μL的PBS來(lái)重懸細(xì)胞。

4、 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過(guò)程數(shù)次，直至細(xì)胞完全裂解。也可以使用超聲波細(xì)胞破碎器超聲處理懸浮液來(lái)裂解細(xì)胞。

5、 2-8℃下以1500×g離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。