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分光光度計的結構與使用方法
日期：2025-01-11 05:40
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摘要：分光光度計的結構與使用方法
分光光度計的結構與使用方法
1.2 特點：靈敏、準確、快速、簡便，在復雜的組分體系中，無需分離，即可以檢測其中所含的極少量物質(zhì)。
1.3 應用：生物<>化學研究中廣泛使用的方法之一，廣泛應用于糖類、蛋白質(zhì)、核酸、酶類等的快速定量檢測。
二、分光光度計的基本結構和工作原理
2.1 分光光度計的分類
2.2 分光光度計工作原理
2.3 分光光度計的基本結構\ n2.4 分光光度計的測量誤差
2.5 顯色反應及其影響因素
2.1 分光光度計的分類
分光光度計的分類
紅外分光光度計：測量波長范圍大于 760 nm 紅外光區(qū)
可見分光光度計：測量波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū)
紫外分光光度計：測量波長范圍為200~400 nm的紫外區(qū)
2.2 分光光度計的工作原理
人眼可見的光只占電磁波譜（400~760nm）的一小部分
它是一種頻率較大的電磁波。電磁波是根據(jù)頻率，從頻率*小的無線電波到頻率*大的γ-射線排列成一排，即電磁波的頻譜，如下圖所示。
2.2.1 分光光度計的光譜范圍
包括波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū)和波長范圍為200~400 nm的紫外光 不同的光源有其獨特的發(fā)射光譜，因此可以使用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.
鎢燈發(fā)射光譜：鎢燈光源發(fā)出的400～760nm波長的光譜，光線經(jīng)棱鏡折射后，由紅、橙、黃、綠、藍、靛、紫組成的連續(xù)色譜圖可以獲得;該色譜圖可作為可見光分光光度計的光源。
氫燈發(fā)射光譜：氫燈可發(fā)射185～400 nm波長光譜，可作為紫外光度計的光源。
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(1)
如果將某種物質(zhì)的溶液放在光源和棱鏡之間，此時屏幕上顯示的光譜就不再是光源的光譜了。它有幾條暗線，就是光中某些波長的光被溶液吸收后的光譜稱為溶液的吸收光譜。
不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的。因此，根據(jù)吸收光譜，可以識別溶液中所含的物質(zhì)。
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(2)\ n 當光通過某種物質(zhì)的溶液時，透射光的強度減弱。由于部分光在溶液表面發(fā)生反射或散射，部分光被構成溶液的物質(zhì)吸收，只有部分光能通過溶液。
入射光=反射光+散射光+吸收光+透射光
如果我們用蒸餾水（或構成此溶液的溶劑）作為“空白”來校正由于反射、色散等因素造成的入射光損失，則：
入射光 = 吸收光 + 透射光
2.2.3 物質(zhì)的吸光度（A）與透射率（T）的關系
令I0為空白校正后的入射光強度； I 是透射光的強度。
根據(jù)實驗，I = I0 ?10-εc l
式中，c表示吸波材料的摩爾濃度； l 表示吸波材料的光路，單位為cm； ε表示吸光材料的摩爾消光系數(shù)，表示物質(zhì)的光吸收特性。不同的物質(zhì)有不同的ε值。所以 I / I0 = 10-εc l
令 T（透射率）= I / I 0 T = 10-εcl
如果用 T 為吸波材料繪制濃度，則得到圖 1-5-2 中的曲線。
由上式可知，1g(1/T) = εc l
lg(l/T) 是物質(zhì)的吸光度 (A) A = 1g (1/T)
2.2.4 朗伯-比爾定律（E = εc l）
上式表明，物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層厚度成正比。這就是光吸收的基本定律——蘭伯特-比爾（Lambert-Beer）定律。
2.3 分光光度計基本結構
無論是哪種類型的分光光度計，它都包括：光源、單色器、吸收池、檢測器和測量儀器。光度計各部件排列順序如圖：
5個基本部分
分光光度計基本部件（一）：
光源：分光光度計上常用的光源有兩種：鎢絲燈或氫燈，在可見光區(qū)、近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)，常用鎢絲燈作為光源；在紫外光領域，多采用氫弧燈。
單色器：劃分混合光解析為單波長光的裝置。它通常用作分光光度計中的色散元件。
Absorption cell cuvette, cuvette, cuvette) 一般由玻璃、石英或熔融石英制成，用于盛裝待測溶液。在 350 nm 以下的紫外區(qū)工作時，必須使用石英池或熔融石英池。
分光光度計的基本組成（二）：
吸收池（比色皿）必須是 光束方向是垂直的。此外，每組比色皿的厚度應完全相同，以免出現(xiàn)錯誤。比色皿壁上的指紋、油漬或沉積物會顯著影響其透光率，因此在使用前務必徹底清潔它們。
常用的光電池有光電管和光電倍增管三種。
測量裝置——常用的紫外和可見光分光光度計有三種測量裝置，即電流表、記錄儀和數(shù)字讀數(shù)單元現(xiàn)代儀器往往配備有自動記錄儀，可以自動跟蹤吸收曲線。
探測器
棱鏡和光柵
棱鏡：光波通過棱鏡時，不同波長的光的折射率不同；因此，不同波長的光可以分開。玻璃對紫外光有很強的吸收作用，所以玻璃棱鏡多用于可見光分光光度計。石英棱鏡可以將光傳播到整個紫外光區(qū)域，因此被廣泛應用于紫外光分光光度計中。
衍射光柵：在石英或玻璃表面雕刻出許多平行線（每英寸約15 000-30 000條）。由于劃線是不透明的，光的干涉和衍射使較長的光波偏轉角變大，而較短的光波偏轉角小，從而形成光譜。
棱鏡單色儀裝置示意圖
光源在照射棱鏡（或光柵）之前，必須先通過一個入射狹縫，然后用平行光鏡使平行光束投射到棱鏡上，通過棱鏡的光再通過另一個聚光鏡，在聚光鏡的焦平面上可以獲得清晰的光譜。例如，將發(fā)射狹縫置于焦線上，通過旋轉棱鏡移動光譜，就可以從發(fā)射狹縫發(fā)出所需的單色光。整個設備被稱為“單色儀”
探測器---光電管
光電管安裝在一個特殊的盒子中，由三層物質(zhì)組成的圓形或矩形片組成。**層 是一種導電性好的金屬，是光伏電池的負極。中間很薄的一層是半導體硒，第三層是鐵，是光伏電池的正極。當光伏電池受到光照射時，半導體硒表面會逸出電子。 ，這些電子只往負極的方向移動，而不是正極，所以上下金屬片之間會產(chǎn)生電流。位置差，連接線時會產(chǎn)生電流
探測器---光電管
光電管 光電管由封裝在真空透明外殼中的半圓柱形陰極和絲陽極組成。陰極上有凹圖。一層光發(fā)射材料，這種物質(zhì)在被光照射時可以發(fā)射電子。當在兩個電極之間施加電位時，發(fā)射的電子流向絲陽極以產(chǎn)生光電流。對于相同的輻射強度，它產(chǎn)生的電流大約是光電池產(chǎn)生的電流的1/4。由于光電管電阻大，產(chǎn)生的電流容易放大。
檢測器---光電倍增管
光電倍增管優(yōu)于普通光電管。將首 次發(fā)射的電子數(shù)放大到數(shù)百萬倍。當電子撞擊兼性陽極時，會導致更多的電子從表面彈出。這些射出的電子被第 二個兼性陽極吸引。 , 它還產(chǎn)生更多的電子。
這個過程重復 9 次后，每個光子可以形成 106 到 107 個電子。這些電子*終被收集在陽極上。得到的倍增器電流可以進一步放大和測量。
[$頁$]
2.4 分光光度法測量誤差
分光光度法測量誤差
選擇合適波長的入射光
控制吸光度范圍A
選擇合適的參考溶液
儀器測量
測量誤差
測量條
項目選擇
2.4.1 儀器測量誤差
根據(jù)朗伯-比爾定律，可以知道只有在一定的濃度范圍內(nèi)，即在一定的吸光度范圍內(nèi)，由光譜光度計測量引起的測量結果的相對誤差較??；當透光率接近0或1.0時，相對誤差趨于無窮大；一般透光率百分比在10%～80%之間（即吸光度在1～0.1之間），濃度測量的相對誤差較??；對于高精度儀器，當吸光度A=0.7-0.2（透光率百分比約為20-60%）時，測量誤差約為1%。
2.4.2 測量條件的選擇
(1)選擇合適波長的入射光：由于有色物質(zhì)選擇性吸收光，為了使測量結果更靈敏，必須選擇溶液*大吸收波長的入射光。
(2)控制吸光度A的準確讀數(shù)范圍：根據(jù)朗伯-比爾定律，吸光度僅控制在0.2~0.7讀數(shù)范圍內(nèi)，測量的準確度更高。
(3)選擇參考溶液：參考溶液用于調(diào)整儀器的工作零點。蒸餾水無色可作為樣品溶液、試劑、顯色劑的參比溶液；否則，應使用不含顯色劑的樣品溶液作為參比溶液。
一、分光光度法的定義及應用
1.1 定義：分光光度法是利用物質(zhì)特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的分析檢測技術。1.2 特點：靈敏、準確、快速、簡便，在復雜的組分體系中，無需分離，即可以檢測其中所含的極少量物質(zhì)。
1.3 應用：生物<>化學研究中廣泛使用的方法之一，廣泛應用于糖類、蛋白質(zhì)、核酸、酶類等的快速定量檢測。
二、分光光度計的基本結構和工作原理
2.1 分光光度計的分類
2.2 分光光度計工作原理
2.3 分光光度計的基本結構\ n2.4 分光光度計的測量誤差
2.5 顯色反應及其影響因素
2.1 分光光度計的分類
分光光度計的分類
紅外分光光度計：測量波長范圍大于 760 nm 紅外光區(qū)
可見分光光度計：測量波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū)
紫外分光光度計：測量波長范圍為200~400 nm的紫外區(qū)
2.2 分光光度計的工作原理
人眼可見的光只占電磁波譜（400~760nm）的一小部分
它是一種頻率較大的電磁波。電磁波是根據(jù)頻率，從頻率*小的無線電波到頻率*大的γ-射線排列成一排，即電磁波的頻譜，如下圖所示。
2.2.1 分光光度計的光譜范圍
包括波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū)和波長范圍為200~400 nm的紫外光 不同的光源有其獨特的發(fā)射光譜，因此可以使用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.
鎢燈發(fā)射光譜：鎢燈光源發(fā)出的400～760nm波長的光譜，光線經(jīng)棱鏡折射后，由紅、橙、黃、綠、藍、靛、紫組成的連續(xù)色譜圖可以獲得;該色譜圖可作為可見光分光光度計的光源。
氫燈發(fā)射光譜：氫燈可發(fā)射185～400 nm波長光譜，可作為紫外光度計的光源。
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(1)
如果將某種物質(zhì)的溶液放在光源和棱鏡之間，此時屏幕上顯示的光譜就不再是光源的光譜了。它有幾條暗線，就是光中某些波長的光被溶液吸收后的光譜稱為溶液的吸收光譜。
不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的。因此，根據(jù)吸收光譜，可以識別溶液中所含的物質(zhì)。
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(2)\ n 當光通過某種物質(zhì)的溶液時，透射光的強度減弱。由于部分光在溶液表面發(fā)生反射或散射，部分光被構成溶液的物質(zhì)吸收，只有部分光能通過溶液。
入射光=反射光+散射光+吸收光+透射光
如果我們用蒸餾水（或構成此溶液的溶劑）作為“空白”來校正由于反射、色散等因素造成的入射光損失，則：
入射光 = 吸收光 + 透射光
2.2.3 物質(zhì)的吸光度（A）與透射率（T）的關系
令I0為空白校正后的入射光強度； I 是透射光的強度。
根據(jù)實驗，I = I0 ?10-εc l
式中，c表示吸波材料的摩爾濃度； l 表示吸波材料的光路，單位為cm； ε表示吸光材料的摩爾消光系數(shù)，表示物質(zhì)的光吸收特性。不同的物質(zhì)有不同的ε值。所以 I / I0 = 10-εc l
令 T（透射率）= I / I 0 T = 10-εcl
如果用 T 為吸波材料繪制濃度，則得到圖 1-5-2 中的曲線。
由上式可知，1g(1/T) = εc l
lg(l/T) 是物質(zhì)的吸光度 (A) A = 1g (1/T)
2.2.4 朗伯-比爾定律（E = εc l）
上式表明，物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層厚度成正比。這就是光吸收的基本定律——蘭伯特-比爾（Lambert-Beer）定律。
2.3 分光光度計基本結構
無論是哪種類型的分光光度計，它都包括：光源、單色器、吸收池、檢測器和測量儀器。光度計各部件排列順序如圖：
5個基本部分
分光光度計基本部件（一）：
光源：分光光度計上常用的光源有兩種：鎢絲燈或氫燈，在可見光區(qū)、近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)，常用鎢絲燈作為光源；在紫外光領域，多采用氫弧燈。
單色器：劃分混合光解析為單波長光的裝置。它通常用作分光光度計中的色散元件。
Absorption cell cuvette, cuvette, cuvette) 一般由玻璃、石英或熔融石英制成，用于盛裝待測溶液。在 350 nm 以下的紫外區(qū)工作時，必須使用石英池或熔融石英池。
分光光度計的基本組成（二）：
吸收池（比色皿）必須是 光束方向是垂直的。此外，每組比色皿的厚度應完全相同，以免出現(xiàn)錯誤。比色皿壁上的指紋、油漬或沉積物會顯著影響其透光率，因此在使用前務必徹底清潔它們。
常用的光電池有光電管和光電倍增管三種。
測量裝置——常用的紫外和可見光分光光度計有三種測量裝置，即電流表、記錄儀和數(shù)字讀數(shù)單元現(xiàn)代儀器往往配備有自動記錄儀，可以自動跟蹤吸收曲線。
探測器
棱鏡和光柵
棱鏡：光波通過棱鏡時，不同波長的光的折射率不同；因此，不同波長的光可以分開。玻璃對紫外光有很強的吸收作用，所以玻璃棱鏡多用于可見光分光光度計。石英棱鏡可以將光傳播到整個紫外光區(qū)域，因此被廣泛應用于紫外光分光光度計中。
衍射光柵：在石英或玻璃表面雕刻出許多平行線（每英寸約15 000-30 000條）。由于劃線是不透明的，光的干涉和衍射使較長的光波偏轉角變大，而較短的光波偏轉角小，從而形成光譜。
棱鏡單色儀裝置示意圖
光源在照射棱鏡（或光柵）之前，必須先通過一個入射狹縫，然后用平行光鏡使平行光束投射到棱鏡上，通過棱鏡的光再通過另一個聚光鏡，在聚光鏡的焦平面上可以獲得清晰的光譜。例如，將發(fā)射狹縫置于焦線上，通過旋轉棱鏡移動光譜，就可以從發(fā)射狹縫發(fā)出所需的單色光。整個設備被稱為“單色儀”
探測器---光電管
光電管安裝在一個特殊的盒子中，由三層物質(zhì)組成的圓形或矩形片組成。**層 是一種導電性好的金屬，是光伏電池的負極。中間很薄的一層是半導體硒，第三層是鐵，是光伏電池的正極。當光伏電池受到光照射時，半導體硒表面會逸出電子。 ，這些電子只往負極的方向移動，而不是正極，所以上下金屬片之間會產(chǎn)生電流。位置差，連接線時會產(chǎn)生電流
探測器---光電管
光電管 光電管由封裝在真空透明外殼中的半圓柱形陰極和絲陽極組成。陰極上有凹圖。一層光發(fā)射材料，這種物質(zhì)在被光照射時可以發(fā)射電子。當在兩個電極之間施加電位時，發(fā)射的電子流向絲陽極以產(chǎn)生光電流。對于相同的輻射強度，它產(chǎn)生的電流大約是光電池產(chǎn)生的電流的1/4。由于光電管電阻大，產(chǎn)生的電流容易放大。
檢測器---光電倍增管
光電倍增管優(yōu)于普通光電管。將首 次發(fā)射的電子數(shù)放大到數(shù)百萬倍。當電子撞擊兼性陽極時，會導致更多的電子從表面彈出。這些射出的電子被第 二個兼性陽極吸引。 , 它還產(chǎn)生更多的電子。
這個過程重復 9 次后，每個光子可以形成 106 到 107 個電子。這些電子*終被收集在陽極上。得到的倍增器電流可以進一步放大和測量。
[$頁$]
2.4 分光光度法測量誤差
分光光度法測量誤差
選擇合適波長的入射光
控制吸光度范圍A
選擇合適的參考溶液
儀器測量
測量誤差
測量條
項目選擇
2.4.1 儀器測量誤差
根據(jù)朗伯-比爾定律，可以知道只有在一定的濃度范圍內(nèi)，即在一定的吸光度范圍內(nèi)，由光譜光度計測量引起的測量結果的相對誤差較??；當透光率接近0或1.0時，相對誤差趨于無窮大；一般透光率百分比在10%～80%之間（即吸光度在1～0.1之間），濃度測量的相對誤差較??；對于高精度儀器，當吸光度A=0.7-0.2（透光率百分比約為20-60%）時，測量誤差約為1%。
2.4.2 測量條件的選擇
(1)選擇合適波長的入射光：由于有色物質(zhì)選擇性吸收光，為了使測量結果更靈敏，必須選擇溶液*大吸收波長的入射光。
(2)控制吸光度A的準確讀數(shù)范圍：根據(jù)朗伯-比爾定律，吸光度僅控制在0.2~0.7讀數(shù)范圍內(nèi)，測量的準確度更高。
(3)選擇參考溶液：參考溶液用于調(diào)整儀器的工作零點。蒸餾水無色可作為樣品溶液、試劑、顯色劑的參比溶液；否則，應使用不含顯色劑的樣品溶液作為參比溶液。