黃曲霉**M1檢測試劑

RIDASCREEN? Aflatoxin M1

簡介

RIDASCREEN?  Aflatoxin M1  30/15產品編號: （R1111）

采用競爭酶標**法定量檢測牛奶、奶粉和奶酪中的黃曲霉**M1。

試劑盒中包括了所有檢測用的試劑。該試劑盒有96個試驗孔（包括標準試驗）

如果進行定量分析，必須有微孔板酶標儀。

（中文翻譯件僅供參考，以試劑盒內附的英文原件為準）

樣品制備

牛奶：脫脂

奶粉：還原、脫脂

奶酪：提取、離心

時間要求：（以10個樣品為例）

牛奶/奶粉………………………….…….…….…大約0.5小時

奶酪………………………………….….………….大約2小時

孵育時間時間……………………….….………….大約1小時

檢測下限

牛奶/奶粉：5ppt

奶酪：50ppt

回收率

牛奶：大約95％

奶粉：大約95％

奶酪：大約102％

交叉反應

黃曲霉**M1………………………………………….100％

黃曲霉**M2…..……………………………………….30％

1. 產品用途

RIDASCREEN? Aflatoxin M1 30/15試劑盒利用競爭性酶**分析方法，用于定量檢測牛奶、奶粉和奶酪中的黃曲霉**M1。

2. 概述

黃曲霉**是Aspergillus flavus 和 Aspergillus parasiticus等霉菌的代謝產物，能致癌，高毒。

黃曲霉**M1是黃曲霉**B1的代謝產物。經攝入含有黃曲霉**B1飼料的奶牛產出的牛奶中，其中便含有黃曲霉**M1。由于黃曲霉**M1相當穩(wěn)定，巴氏**法也無法將其殺滅，所以檢測黃曲霉**M1不僅要在飼料原料中檢測，而且在*終產品中也需要進行鑒定。自1999年一月開始，歐盟就制定了黃曲霉**殘留的檢測限，黃曲霉**M1的檢測限為0.05 μg/l （50 ppt）。

使用RIDASCREEN?  Aflatoxin M1 30/15可以**定量檢測牛奶、奶粉和奶酪中的黃曲霉**M1。

3. 測定原理

測定的基礎是抗原抗體反應。微孔板包被有針對黃曲霉**M1的特異性抗體。加入標準或樣品溶液和在洗板后加入黃曲霉**酶標記物，游離黃曲霉**M1與黃曲霉**M1酶標記物競爭結合黃曲霉**M1抗體的結合位點（競爭性酶**分析方法）。沒有連接的酶標記物在洗滌步驟中被除去。加入底物/發(fā)色劑到孔中并且孵育。結合的酶標記物將無色的發(fā)色劑轉化為藍色的產物。加入反應停止液后使顏色產生由藍色變成黃色。在450nm處測量，吸光值與樣品中黃曲霉**M1濃度成反比。

4． 提供的試劑

每一個盒中的試劑足夠進行96個測量（包括標準測定孔）

盒中的材料如下：

1×96孔板（12條 X  8孔）包被有黃曲霉**M1抗體

6×黃曲霉**M1標準液，1.3 ml/瓶

濃度為：0 ppt， 5 ppt，10 ppt，20 ppt，40 ppt，80 ppt

黃曲霉**M1的牛奶緩沖液

1×酶標記物（1.3ml）……………………………….紅色帽

過氧化物酶標記物的黃曲霉**M1

1×底物/發(fā)色劑（12ml）…………………………….. 藍色帽

微紅色，包含四甲基苯醌

1×反應停止液（14ml）...….…………………... ……黃色帽

為1N硫酸

1×緩沖液1（20ml）

樣品稀釋緩沖液

1×緩沖液2（12ml）...….…………………... …….…白色帽

酶標記物稀釋緩沖液

1×洗滌緩沖液

為10Mm的磷酸緩沖液（pH7.4），包含0.05%的Tween20

5. 需要的材料但盒中不提供

5.1設備

－－－－微孔板酶標儀（450nm）

－－－－離心機

－－－－巴氏吸液管

－－－－刻度吸量管

－－－－50ul，100ul，400ul微量加樣器

－－－－只用于奶酪檢測

－－－－振蕩器

－－－－蒸發(fā)器

5.2 試劑

－－－－甲醇

－－－－n-庚烷

－－－－二氯甲烷

－－－－PBS-緩沖液，pH 7.2：

0.55g  NaH2PO4 x H2O+ 2.85g Na2HPO4 x 2H2O +9gNaCl , 加入蒸餾水至1000ml

6.  操作者應該注意之事項

－－－－標準液含有黃曲霉**M1（致癌），要特別小心，應戴手套，避免試劑接觸皮膚

－－－－使用過的玻璃容器*好用pH7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡過夜

－－－－反應停止液為1N硫酸，避免接觸皮膚

－－－－不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度的降低

－－－－不要交換使用不同批號的盒中試劑

7.   儲存條件

－－－－保存試劑盒于2-80C。不要冷凍

－－－－將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封

－－－－標準物質對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下

－－－－無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下

8．  試劑變質的跡象

發(fā)色試劑若顯色表明發(fā)色劑變質，應當棄之。

0標準的吸光度值小于0.6個單位 （A450nm<0.6）時，表示試劑可能變質。

9． 樣品處理

9.1. 牛奶

－－－－取牛奶樣品，用冷凍離心機（3500g ，10℃）離心10分鐘去除脂肪

（如沒有冷凍離心機，可將樣品先冷卻到10℃，再離心）

－－－－離心后用巴氏吸液管徹底去除上層奶油。

－－－－取脫脂牛奶用于檢測（每孔100μl）

9.2. 奶粉

－－－－用天平稱取10g奶粉到容量瓶加去離子水到100ml。

（還原牛奶）

－－－－震蕩5分鐘，使充分溶解。

－－－－按照9.1牛奶樣品處理步驟進行

9.3. 奶酪

代表性的樣品應該研磨，充分混合。整個均質過程不要加入任何液體。

如果奶酪表面呈現(xiàn)出不同狀態(tài)，則不要取奶酪表面作為樣品，否則將影響檢測結果。

－－－－稱取2 g研磨過的奶酪，裝入玻璃離心管中。

－－－－加入40ml二氯甲烷，放在振蕩器上震蕩15分鐘。

－－－－過濾后取10ml濾液60 °C氮氣吹干

－－－－將吹干殘留的油狀物用0.5 ml甲醇、0.5 ml PBS緩沖液（參見5.2.）和1 ml庚烷充分混合溶解。

－－－－離心: 15分鐘 / 2700 g / 15 °C 

－－－－完全除去上層庚烷層。

－－－－用巴氏移液管小心移取部分甲醇水層

－－－－取100 μl甲醇水層用400 μl緩沖液1稀釋成為含10%甲醇的溶液

－－－－每孔用100 μl進行檢測。 

備注:如果需要進一步稀釋溶液，則使用緩沖液1進行稀釋。

10.  酶標**分析程序

10.1測定之前注意事項

1. 用之前將所有試劑回升至室溫（20-25℃）。

2. 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。 

3. 在使用中不要讓微孔干燥。

4. 在EIA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細按照推薦的洗板順序操作是EIA測定程序中的要點。

5. 在所有孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板。

10.2 黃曲霉**M1酶標記物

Aflatoxin M1 酶標記物（紅帽）為濃縮液。由于稀釋了的酶標記物穩(wěn)定性不好，因此只稀釋需用量的酶標記物。稀釋前酶標記物應輕輕振蕩混勻。酶標記物用緩沖液2（白帽）以1: 11的比例稀釋（400 μl濃縮液+ 4.0 ml 緩沖液，足夠4個微孔板條32孔檢測）

10.3 洗滌緩沖液

在試劑盒中提供一包洗滌緩沖液的粉劑，一包粉劑溶解于1升的蒸餾水中，制備好的洗滌緩沖液在4oC條件下可以保存4周。

10.4 包被有抗體的微孔板條

錫箔袋沿橫向邊壓封線外側剪開。取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-80C。不要冷凍。

10.5  測定程序  （在20-25 oC條件下操作）

1．將足夠標準和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標準及樣品做平行，并記錄標準及樣品的位置。

2.  加入100ul的標準或處理好的樣品到各自的微孔中，輕輕震板混合，在室溫（20-25 oC）暗處孵育30分鐘。

3．倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中液體。每孔注入250ul洗滌緩沖液（見10.3）再次倒出孔中的液體，完全除去孔中的液體，重復操作洗滌步驟兩次以上。

4．加入100ul酶標記物（紅色帽）到微孔底部，輕輕震板混合，在室溫（20-25 oC）暗處孵育15分鐘。

5．倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中液體。每孔注入250ul洗滌緩沖液（見10.3）再次倒出孔中的液體，完全除去孔中的液體，重復操作洗滌步驟兩次以上。

6．加入100ul底物/發(fā)色劑到微孔中，混合后在室溫（20-25 oC）暗處孵育15分鐘。

7．加入100ul反應停止液到微孔中，混合好在450nm處測量吸光度值，以空氣為空白，15分鐘內讀取光度值。

11.  結果

所獲得的標準和樣品吸光度值的平均值除以**個標準 （0標準） 的吸光度值再乘以100。因此0標準等于100%并且以百分比給出吸光度值。

標準的吸光度值（或樣品）

────────────── × 100= %吸光度值

0標準的吸光度值

計算的標準值繪成為一個以黃曲霉**M1濃度（ng/l）的半對數(shù)坐標系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在10-40 ng/l （ppt）范圍內應當成為線性，相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。

為了得到樣品中黃曲霉**M1的含量（ng/l），在標準曲線上讀取的濃度必須乘以相應的稀釋倍數(shù)。樣品的稀釋倍數(shù)如下：

牛奶/奶粉........................…………………….................1

奶酪....................................................……………….... 10

R-Biopharm開發(fā)出用于計算ELISA試劑盒檢測結果的專用軟件RIDA? SOFT，可以向當?shù)胤咒N商索取該軟件。

12．  靈敏度

RIDASCREEN?  Aflatoxin M1 30/15試劑盒的*低檢測下限為大約5 ppt，按照樣品處理記錄，牛奶、奶粉的檢測限為5 ppt，奶酪的檢測限為5 0ppt。

13． 特異性

RIDASCREEN?黃曲霉**M1 30/15試劑盒的特異性通過對相應的霉菌**交叉反應性分析而得到：

交叉反應：黃曲霉**M1....................................... 100 %

黃曲霉**M2.........……......................... 30 %

14．  再現(xiàn)性

由三個不同的實驗結果確定了室內精密度，圖2顯示出RIDASCREEN?  Aflatoxin M1 30/15試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應黃曲霉**M1濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

15.  回收率

牛奶的回收率大約 95 % ，平均變異系數(shù)約14 %。

奶酪的回收率大約為102 % ，平均變異系數(shù)大約為11 %。