摘要：該試驗(yàn)旨在研究病原菌感染與奶牛**炎發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性。根據(jù)**分離鑒定程序和菌落總數(shù)計(jì)數(shù)法測定了６３６份乳樣，涉及無**炎乳、不同等級(jí)的隱型**炎乳、臨床型乳。結(jié)果表明，該牧場奶牛所患的**炎是以單種**感染為主，并且在一定的**感染比例下，**炎的發(fā)病程度與桿菌的相對(duì)比例正相關(guān)，與葡萄球菌的相對(duì)比例負(fù)相關(guān)；同時(shí)，**炎的發(fā)病程度還與菌落總數(shù)的含量正相關(guān)。無**炎乳、隱型**炎乳、臨床型**炎乳中的菌落總數(shù)差異極顯著（Ｐ＜０．０１）。結(jié)果提示，本場**炎的發(fā)病程度與桿菌所占的比例和菌落總數(shù)成正相關(guān)關(guān)系。
關(guān)鍵詞：**；**炎；菌落總數(shù)
高度集約化奶牛場奶牛**炎病原菌的分離計(jì)數(shù)及感染規(guī)律
（１．揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州２２５００９；２．上海牛奶集團(tuán)，江蘇大豐２２４１００）
**炎是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)*常見的**之一，可以導(dǎo)致**炎的因素雖然有很多，但微生物污染是引起**炎*主要的病因，因此對(duì)乳汁進(jìn)行**的分離鑒定和菌落計(jì)數(shù)，能夠較直觀的了解奶牛**炎的發(fā)病原因，有助于對(duì)**炎進(jìn)行早期控制、幫助獸醫(yī)準(zhǔn)確的判斷病情并對(duì)其對(duì)癥**或者淘汰。雖然國內(nèi)眾多研究者對(duì)奶牛**炎的**感染情況進(jìn)行了研究，對(duì)該病的防治起了很積極的作用，但他們的結(jié)果也表明了不同的地區(qū)病原菌的發(fā)病情況存在著十分顯著的不同［１］。有鑒于此，本試驗(yàn)旨在探索在高度集約化養(yǎng)殖條件下奶牛病原菌感染與**炎發(fā)病程度之間的關(guān)系，為生鮮乳的質(zhì)量控制提供可操作素材，并為牧場**炎的防控和對(duì)癥**提供相應(yīng)的理論支持。
１ 材料與方法
１．１ 牛群及飼養(yǎng)管理 選取靠近海邊的某大型集約化奶牛場，本場牛群為進(jìn)口澳大利亞荷斯坦奶牛，平均胎次為２到３胎，ＴＭＲ全價(jià)日糧，散欄飼養(yǎng)，自
由采食，采用現(xiàn)代化轉(zhuǎn)盤機(jī)械擠奶，牛床鋪墊干燥過的木屑，污水糞尿由自動(dòng)刮糞板定時(shí)清理干凈，全場定期****。
１．２ 試驗(yàn)儀器 電熱鼓風(fēng)干燥箱，電熱恒溫培養(yǎng)箱，立式壓力蒸汽**鍋，打孔機(jī)，顯微鏡，震蕩儀，超凈臺(tái)、天平、分析天平。
１．３ 培養(yǎng)基 血清肉湯培養(yǎng)基、血平板、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、卻甫曼培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。
１．４ 試驗(yàn)方法
１．４．１ 蘭州隱型**炎測試液（ＬＭＴ）測試 先擦拭**及**，棄去前３把乳汁，再將各乳區(qū)的乳樣擠在對(duì)應(yīng)的盤中，診斷盤傾斜４５℃，棄去多余乳汁，診斷盤中各乳皿大約２ｍＬ乳樣。每個(gè)樣品加２ｍＬ?。蹋停栽\斷液與蒸餾水以１∶３混合后的稀釋液。之后做水平樣同心圓搖動(dòng)，上下傾斜搖動(dòng)數(shù)十秒后作判定。ＬＭＴ診斷液與乳汁混合后按凝膠反應(yīng)的程度分為“－”乳樣、隱型“＋”乳樣、隱型“＋＋”乳樣、隱型“＋＋＋”乳樣、臨床型乳樣。
１．４．２ 病原菌的分離鑒定?。ǎ保┤闃拥牟杉?*按常規(guī)擠奶**程序，擠奶后采樣，標(biāo)明牛號(hào)、乳區(qū)，放入有冰袋的泡沫盒中，３ｈ內(nèi)送檢；（２）增菌培養(yǎng)：對(duì)采集的乳樣搖勻后，在無菌環(huán)境下吸?。保恚讨裂迦鉁囵B(yǎng)基中，１５０～１６０ｒ／ｍｉｎ離心，３７℃恒溫?fù)u床過夜；（３）分離鑒定：搖勻乳樣，將每份乳樣接種于血平板中，放置于３７℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，２４ｈ后觀察**的培養(yǎng)特性，根據(jù)菌體形態(tài)、溶血情況及染色特性初步判定**類屬［２－４］；（４）革蘭染色及鏡檢：對(duì)每一個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，初步區(qū)分**
革蘭染色的陰性和陽性。根據(jù)菌落的生長特性和鏡檢結(jié)果將其分為葡萄球菌類、桿菌類、鏈球菌類、酵母類等。對(duì)于血平板上不能確定的菌落，對(duì)其在鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)。按編號(hào)詳細(xì)記錄主要病原菌的鑒別結(jié)果，并整理每頭牛、每個(gè)乳區(qū)主要病原菌的鑒別結(jié)果。具體操作為：準(zhǔn)備好透明清晰潔凈的抹片、滴上**水后均勻的涂布菌落、自然干燥后火焰固定，之后進(jìn)行革蘭染色，即可進(jìn)行顯微鏡觀察。革蘭陽性菌呈藍(lán)紫色，革蘭陰性菌呈紅色。根據(jù)菌體形態(tài)、溶血情況及革蘭染色特性初步判定**類屬。
１．４．３ 菌落總數(shù)的測定 以無菌吸管吸?。玻担恚棠虡幼⒂谑⒂校玻玻担恚躺睇}水的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成１∶１０的樣品勻液。用１ｍＬ無菌吸管吸取１∶１０樣品液１ｍＬ，注于盛有９ｍＬ稀釋液的無菌離心管中，反復(fù)吹打使其混合均勻，制成１∶１００的樣品勻液，重復(fù)稀釋步驟，制備１０倍系列稀釋液。選擇適宜稀釋度的樣品勻液，?。保恚虡悠穭蛞河跓o菌平皿內(nèi)，將１５～２０ｍＬ營養(yǎng)瓊脂（保育后溫度以不燙手為宜）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，３７℃培養(yǎng)４８ｈ。培養(yǎng)結(jié)束后肉眼觀察計(jì)數(shù)，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。
菌落總數(shù)以菌落形成單位表示。
２ 結(jié)果與分析
２．１ 隱型**炎檢測 對(duì)本群體轉(zhuǎn)盤奶牛進(jìn)行全區(qū)普測，共檢測奶?？傆?jì)３?。矗埃差^，１３?。叮埃競€(gè)乳區(qū)，隱型**炎檢測結(jié)果見表１。
２．２ **分離鑒定結(jié)果 按照隱型**炎測試的分級(jí)結(jié)果對(duì)亞臨床型**炎的牛群進(jìn)行采樣，并區(qū)分乳區(qū)，對(duì)有臨床型**炎的奶牛同時(shí)取樣，在６３６
份奶樣中分離到的３種主要病原菌共５４５例，其中葡萄球菌１６５例，占分離菌株的３６．２％；桿菌２０５例，占分離菌株的４５％；葡萄球菌和桿菌混合感染７３例，占分離菌株的１６％。葡萄球菌和鏈球菌混合感染８例，占分離菌株的１．８％，桿菌和鏈球菌混合感染２例，占分離菌的０．４％，葡萄球菌、桿菌和鏈球菌混合感染３例，占分離菌的０．７％，沒有發(fā)現(xiàn)鏈
球菌單獨(dú)感染的情況。鑒定結(jié)果見表２、表３、表４。
由此可以看出，本場奶牛**炎以單種**感染為主，占５８．２％，并且隨著**炎情況的加重，不同**的比例也會(huì)有規(guī)律的變化：從陰性乳到臨床
型**炎乳，葡萄球菌的比例在下降，桿菌的比例在上升。到臨床型**炎時(shí)，桿菌的比例甚至已經(jīng)達(dá)到了葡萄球菌的４倍，初步可以判斷出本場受桿菌類的環(huán)境致病菌的影響較強(qiáng)，這個(gè)結(jié)果也符合牧場方對(duì)該場**感染模式的判定。
２．３菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 對(duì)陰性乳，分等級(jí)的隱性**炎乳和臨床型**炎乳，分別按照國標(biāo)對(duì)其進(jìn)行菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)，其結(jié)果見表５、表６。
３ 討論
據(jù)國際奶牛聯(lián)合會(huì)的資料統(tǒng)計(jì)：隱型**炎在產(chǎn)奶牛中的患病率達(dá)５０％，西歐部分經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國家奶牛隱型**炎的發(fā)病率為２５％［５］，我國奶牛的乳
中國獸醫(yī)雜志２０１３年（第４９卷）第７期２５房炎發(fā)病率高于世界平均水平［６］，包括隱型**炎在內(nèi)的發(fā)病率平均為７０％。但對(duì)本場３?。矗埃差^轉(zhuǎn)盤擠奶的奶牛進(jìn)行**炎檢查，**炎頭數(shù)發(fā)病率為１８．７％，乳區(qū)發(fā)病率為８．３２％，遠(yuǎn)低于國內(nèi)平均水平。造成本場這種低水平**炎的原因很多，可能是以下幾種因素綜合作用的結(jié)果：（１）有研究證明［６－８］不同胎次的奶牛發(fā)病率差異極顯著（Ｐ＜０．０１），本場奶牛主要是２～３胎次，**受損的情況比較輕。（２）牛群的ＢＣＳ評(píng)分大部分集中在２．６～３．４歲之間，處于*健康的體況范圍。（３）在擠奶方式上采用現(xiàn)代化轉(zhuǎn)盤機(jī)械擠奶，有效地保護(hù)了乳腺，減少了人為原因造成乳區(qū)物理性傷害。（４）牛舍環(huán)境衛(wèi)生條件較好，減少了微生物的生存空間。及時(shí)檢出及**發(fā)病牛只，切斷了傳染性**的傳播鏈。
國內(nèi)外公認(rèn)隱型**炎的主要致病菌為葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌，以上３者共占總檢出菌的９０％以上。通過對(duì)本場奶樣**的分離鑒定，確定本場的**感染主要是葡萄球菌（４５．７％）和桿菌（５１．９％），并且絕大部分是單種**造成的感染。隱型**炎“＋”的奶樣發(fā)病程度較輕，它和陰性奶中的桿菌與葡萄球菌的相對(duì)比例相差不大，都約為０．５７％～０．６％，隱型“＋＋”的奶樣中桿菌與葡萄球菌的的相對(duì)比例為１．３５％，隱型“＋＋＋”奶樣中的桿菌與葡萄球菌的相對(duì)比例為１．４４％，而到了臨床型**炎時(shí)，桿菌與葡萄球菌的相對(duì)比例甚至達(dá)到了４．０％，我們可以很明顯的看到，在一定的**感染比例下，**炎的發(fā)病程度與桿菌相對(duì)比例正相關(guān)，與葡萄球菌的相對(duì)比例負(fù)相關(guān)。此外，**炎的發(fā)病程度還與菌落總數(shù)的含量正相關(guān)，隨著菌落總數(shù)的增加，**炎的程度也增加，據(jù)本場的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，陰性奶中的菌落總數(shù)均值為６．９×１０４ ＣＦＵ，而隱型“＋”的奶樣中菌落總數(shù)達(dá)到了２．６×１０５ＣＦＵ，隱型“＋＋＋”的奶樣中菌落總數(shù)達(dá)到了１．５×１０６?。茫疲?，臨床型奶樣中的菌落總數(shù)更是達(dá)到了２．４×１０６?。茫疲?，不同程度的**炎乳中菌落總數(shù)的差異極顯著（Ｐ＜０．０１）。此外，通過表６的數(shù)據(jù)我們也可以看出，不同程度的**炎乳樣對(duì)桿菌和葡萄球菌含量的影響幾乎也全部都為極顯著（Ｐ＜０．０１）。
本試驗(yàn)的結(jié)論在一定程度上給牧場提供了控制**炎發(fā)病率的思路，通過有針對(duì)性的抑制桿菌的生存、傳播、感染等，并降低**內(nèi)的菌落總數(shù)，可以有效地抑制**炎的發(fā)病情況，為生鮮乳生產(chǎn)的質(zhì)量控制提供可操作素材，而良好的奶源是**乳產(chǎn)品生產(chǎn)的保證，這種通過飼養(yǎng)階段關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的控制生產(chǎn)**的生鮮乳是一種十分值得提倡和推廣的途徑。
公安機(jī)關(guān)備案號(hào)：
