簡介
化學(xué)品引起的呼吸道過敏反應(yīng)，不論是體內(nèi)還是體外，目前尚缺少有效的評價方法。因此，新實驗方法的開發(fā)收到極大的關(guān)注，特別是考慮到REACH（《化學(xué)品注冊、評估、許可和限制》）新的法規(guī)規(guī)定。應(yīng)注意的是，REACH指導(dǎo)方針明確指出，應(yīng)盡量避免動物實驗，其中，化妝品材料應(yīng)在2013年**禁止動物實驗。所以，建立體外模型顯得非常必須和十分的緊迫。
為了化學(xué)品呼吸道過敏反應(yīng)的人肺體外模型的建立，我們開發(fā)一種三維共培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬人肺肺泡區(qū)。該系統(tǒng)，采用氣液界面暴露技術(shù)，使體外培養(yǎng)的細胞在完全模擬人肺部環(huán)境下暴露于氣溶膠或顆粒物質(zhì)。
方法
建立三種類型的共培養(yǎng)系統(tǒng)：
雙細胞共培養(yǎng)模型：
•人肺上皮細胞（ECs）：A549細胞
•人肺泡巨噬細胞（AMs）：U937細胞
三細胞共培養(yǎng)模型，類型1和類型2：
• ECs: A549 cells
• AMs: U937 cells, differentiated to AMs with PMA
• Human immature dendritic cells (DCs): DCs differentiated from human peripheral blood monocytes
ECs種在BD細胞培養(yǎng)插件上，培養(yǎng)7天。形成上皮細胞層后，AMs種在ECs層上。對于三細胞共培養(yǎng)類型1，DCs培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)插件上（如圖1A）；對于三細胞共培養(yǎng)類型2，DC細胞種在上皮層內(nèi)側(cè)（如圖1B）。
細胞培養(yǎng)的終點特征：
• EC層完整性：用Millicel-ERS (Millipore)測量跨上皮電阻（TEER）。
• EC層功能：表面活性蛋白(proSP-C)染色。
• Immature DCs: Staining of DC-marker CD1a and maturation markers CD83/CD86
使用Cultex®體外暴露染毒系統(tǒng)（如圖1C,D）的共培養(yǎng)模型對呼吸敏化劑和刺激物進行暴露染毒實驗。
結(jié)果
TEER測量：電阻值隨著時間增加。*高值出現(xiàn)在第7天（紅色箭頭），此時對插件進行處理（圖.2）。
圖 2: 每個值是3個腔室內(nèi)測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值。
Staining of surface markers: ECs中表面活性蛋白proSP-C產(chǎn)物，用**化學(xué)染色方法所示（圖.3A）。作為陰性對照，AMs沒有染色陽性proSP-C (圖. 3B)。使用**化學(xué)染色方法（圖.3C）和流式方法（圖.3D）分析未成熟的DCs。兩種方法表明，培養(yǎng)的DC具有CD86/CD83陰性表達。流式表明DC-marker CD1a細胞呈陽性（圖.3D）。
圖3：**細胞化學(xué)（A-C）和流式（D）的表面標(biāo)記。A，B：ECs（A）和AMs（B）DAPI染色（藍色信號）和抗-proSP-C（紅色）。在ECs上檢測到ProSP-C，但是在AMs上檢測不到。C：DCs DAPI染色（藍色信號）和CD86（紅色）。大部分細胞CD86呈陰性（箭頭）。 D：DCs流式分析。
討論
以上是采用Cultex®體外細胞暴露技術(shù)建立化學(xué)品呼吸道過敏反應(yīng)的人肺體外模型。Cultex®這種復(fù)雜三維細胞共培養(yǎng)體統(tǒng)的使用，我們能夠鑒定生物標(biāo)記物的呼吸道過敏反應(yīng)。由于體外暴露技術(shù)可以直接使用粉末狀顆粒物，不必要求必須具有水溶性特征，所以這一方法可擴展適用各種化學(xué)品。
公安機關(guān)備案號：
