Taqman探針雖然只發(fā)展了短短的幾十年，但是無(wú)論在技術(shù)上還是在應(yīng)用上都有了長(zhǎng)足的發(fā)展，尤其是配合著細(xì)胞生物學(xué)，病理學(xué)等方面的發(fā)展，應(yīng)用領(lǐng)域有了很大的延伸。
Taqman定量應(yīng)用可以分為幾個(gè)層次，**個(gè)層次自然就是應(yīng)用到臨床檢測(cè)，微生物檢測(cè)和食品檢測(cè)等方面，**個(gè)層次是分子生物學(xué)層面的，包括對(duì)各種基因的表達(dá)進(jìn)行定量或者半定量的分析(同一基因在不同組織中的表達(dá)差異，同一基因在不同**處理后的表達(dá)差異，轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)等)，第三個(gè)層次是包括突變分析，等位基因分析，DNA甲基化檢測(cè)等在內(nèi)的遺傳學(xué)檢測(cè)和單核苷酸多態(tài)性分析。
**個(gè)層次：實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用
這個(gè)層面主要是一些微生物檢測(cè)，食品檢測(cè)，環(huán)境監(jiān)測(cè)以及一些醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用(病源體檢測(cè)，基因病診斷，傳染病檢測(cè)，微小殘留病變檢測(cè)等)，在這些方面定量PCR與傳統(tǒng)的方法具有相似的靈敏度，但是耗時(shí)少，需要的勞動(dòng)力也少，而且它們既可以從活著的也可以從死的病原菌中檢測(cè)和定量核酸，而傳統(tǒng)的微生物方法只能檢測(cè)活的病原菌。
這些主要應(yīng)用到的就是定量PCR在核酸濃度上的簡(jiǎn)單定量，由于之前要想在分子操作過(guò)程中知道核酸的濃度，主要應(yīng)用的方法是瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)，但是這兩種方法前者靠主觀判斷，造成的偏差較大;后者很易受樣品中雜質(zhì)的影響。因此定量PCR由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)、無(wú)污染性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)當(dāng)然成為了**。
**個(gè)層次：分子生物學(xué)應(yīng)用
檢測(cè)應(yīng)用和分子生物學(xué)應(yīng)用都是利用了定量PCR對(duì)基因表達(dá)的檢測(cè)，只不過(guò)前者是在臨床實(shí)際應(yīng)用上，而后者則是側(cè)重于科學(xué)研究。在分子生物學(xué)上定量PCR的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，包括基因轉(zhuǎn)錄檢測(cè)(即同一基因在不同組織中的表達(dá)差異)，轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)，腫瘤耐藥基因表達(dá)等在內(nèi)的高通量基因表達(dá)檢測(cè)(雖然Taqman相對(duì)于SYBR Green熒光染料，沒(méi)有那么靈活，但是在陸續(xù)各生物技術(shù)公司推出一些相應(yīng)試劑盒，也保證了Taqman在高通量方面的應(yīng)用)。之前的高通量篩選基因表達(dá)差異的技術(shù)是cDNA 芯片和差異顯示，但這兩種技術(shù)的缺點(diǎn)是只能定性而非完整意義上的定量分析。定量PCR 技術(shù)的出現(xiàn)無(wú)疑為這種檢測(cè)提供了極大的方便，利用定量 PCR檢測(cè)產(chǎn)物并進(jìn)行熔解曲線分析的方法，已經(jīng)對(duì)cDNA 芯片和差異顯示技術(shù)的結(jié)果進(jìn)行了確認(rèn)，而且得到了更加完整和**的結(jié)果。
第三個(gè)層次：遺傳學(xué)，SNP分析以及深入應(yīng)用
點(diǎn)突變分析和等位基因分析：用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的 Taqman探針?lè)謩e與野生型和突變基因雜交。探針雜交的效率和其后的切除與雜交有關(guān)。如果一種染料的熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于另一種則說(shuō)明它是一個(gè)純合子，如果兩種熒光信號(hào)都增加則表明是一個(gè)雜合子。實(shí)時(shí)定量PCR 的數(shù)據(jù)被標(biāo)在xy坐標(biāo)軸上來(lái)區(qū)分特異的基因型。利用這種方法，能在不到兩個(gè)小時(shí)內(nèi)很快對(duì) 96個(gè)樣本進(jìn)行基因分型。這一方法*先由Sevall在文章“Rapid allelic discrimination fromreal-time DNA amplification”中提及。
為了檢測(cè)突變體，可以設(shè)計(jì)兩種不同顏色的探針：一個(gè)探針設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)野生型，可以標(biāo)記FAM，另一個(gè)標(biāo)記JOE的探針來(lái)檢測(cè)突變體。通常兩個(gè)探針的差別只有1個(gè)bp，由于兩個(gè)探針相差極小，因此一般推薦使用嚴(yán)格的反應(yīng)條件。通過(guò)分析數(shù)據(jù)，兩個(gè)通道的結(jié)果會(huì)呈現(xiàn)在一個(gè)屏幕中，沒(méi)有標(biāo)記物的曲線是CH1結(jié)果，有循環(huán)數(shù)的是CH2，*多可以有四個(gè)探針(兩個(gè)突變體)可以被分析，在編輯好基因型名稱，將域值調(diào)整到0以上后，結(jié)果就會(huì)在圖下方的表格中顯示出來(lái)。
DNA甲基化分析：CG 島內(nèi)胞嘧啶的甲基化形成 5’-甲基胞嘧啶被認(rèn)為和許多人類**特別是癌癥有關(guān)。Laird等人利用一種被稱作 Methylight 的技術(shù)。 Methylight 是一種基于 Taqman 探針的甲基化特異定量 PCR技術(shù)。在擴(kuò)增之前先處理DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman 探針來(lái)區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。特異的引物和 Taqman 探針被用來(lái)區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它實(shí)時(shí) PCR 方法一樣，Methylight無(wú)需電泳，因而提高了反應(yīng)的靈敏性和通量。這種方法的靈敏性在食道癌病人血液中癌細(xì)胞異常甲基化的DNA檢測(cè)中被證明。
低密度表達(dá)譜分析：這一方面主要是配合ABI的系列產(chǎn)品：TaqMan® Low DensityArrays。這個(gè)芯片是從人，小鼠和大鼠的基因中挑選的4萬(wàn)個(gè)arrays，可以根據(jù)用戶要求在反應(yīng)板中固化不同基因的檢測(cè)探針和引物，同時(shí)檢測(cè)1個(gè)標(biāo)本的384個(gè)不同的基因或8個(gè)標(biāo)本的48個(gè)不同的基因，而且這個(gè)試劑盒是pre-loaded，方便使用，同其反應(yīng)體積小(2ul)，節(jié)省試劑的優(yōu)點(diǎn)一起構(gòu)成了這個(gè)適用于標(biāo)準(zhǔn)化，中高通量基因表達(dá)研究的試劑。
SNP分析：SNPs，即單核苷酸多態(tài)性，這種人類*常見(jiàn)的可遺傳變異占據(jù)了所有已知多態(tài)性的90%以上，因此作為研究個(gè)體對(duì)不同**的易感性或者個(gè)體對(duì)特定**的不同反應(yīng)有著重要的意義，也因此國(guó)際人類基因研究學(xué)會(huì)花費(fèi)大量的資金來(lái)完**類單體型圖譜。SNP分析從根本上來(lái)說(shuō)其實(shí)就是確定一對(duì)染色體的每種基因的兩個(gè)拷貝，哪種點(diǎn)突變?cè)谶@兩個(gè)拷貝中存在，因此利用定量PCR方法，并配合芯片技術(shù)可以快速靈敏的檢測(cè)到SNP結(jié)果。ABI號(hào)稱有數(shù)以千記的定量PCR試劑盒，自然在這方面也不會(huì)留下空白，TaqMan SNP Genotyping Assays包含了一百萬(wàn)的HapMap SNPs(人類單核苷酸多態(tài)性圖譜SNPs)，方便SNP分型高通量研究。
細(xì)胞因子分析：細(xì)胞因子是一種由細(xì)胞分泌、能調(diào)節(jié)自身和其他細(xì)胞功能的小分子可溶性蛋白質(zhì)或多肽。這種調(diào)節(jié)蛋白主要通過(guò)調(diào)節(jié)**反應(yīng)而在**系統(tǒng)中起著核心作用。因此在許多**致病途徑，對(duì)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)譜的可靠定量是很重要的。由于受檢樣本中細(xì)胞因子含量往往往往都比較低下，因此定量PCR以其高敏感性和準(zhǔn)確性在細(xì)胞因子的定量中越來(lái)越受到青睞。
MicroRNA分析：miRNA這種小分子從2003年一直“火”到了如今，其魅力不可小窺，傳統(tǒng)的檢測(cè)和定量miRNA的方法是northern雜交,芯片技術(shù)以及核糖核酸酶保護(hù)分析(ribonuclease protectionassays)，這些方法都需要標(biāo)記探針并與純化的RNA進(jìn)行雜交。但是由于成熟的活性miRNA及其前體有一段相同的靶序列，而基于雜交的各種技術(shù)又無(wú)法通過(guò)分子大小將它們區(qū)分，因此很難專一性的識(shí)別成熟miRNA，結(jié)果導(dǎo)致很高的前體背景信號(hào)，而且這些技術(shù)需要標(biāo)記步驟或放射性同位素，費(fèi)時(shí)，費(fèi)錢還不討好。利用Taqman技術(shù)可以發(fā)揮定量PCR的優(yōu)點(diǎn)來(lái)解決這些問(wèn)題，但是要定量miRNA又一個(gè)*大的難題：即小RNA分子太短(-22nt)，無(wú)法按常規(guī)設(shè)計(jì)隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR。ABI提供了一種試劑盒：TaqMan® MicroRNAAssays，設(shè)計(jì)特異性的莖環(huán)狀反轉(zhuǎn)錄引物，這樣有兩個(gè)好處：專一性的與成熟miRNA結(jié)合;形成反轉(zhuǎn)錄引物/成熟miRNA復(fù)合物，并在miRNA的5’末端延伸。這樣就得到一個(gè)較長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增子，為進(jìn)一步做實(shí)時(shí)定量PCR提供了符合要求的摸板。
公安機(jī)關(guān)備案號(hào)：
