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GIBCO血清培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞技術(shù)

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點(diǎn)擊量: 212891 來源: 上海拜力生物科技有限公司

GIBCO血清培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞技術(shù)




材料:乳鼠(1-3d)

試劑:DMEM/F12(gibco),F(xiàn)BS(四季青),0.125%混合酶(胰酶和膠原酶1),GIBCO血清

器材:高壓包1(眼科剪、鑷2套,200目濾網(wǎng)1個(gè)),高壓包2(消化用小錐形瓶及轉(zhuǎn)子和蓋子,9cm平皿1套,100ml燒杯2個(gè)),高壓包3(小紗布?jí)K,細(xì)胞計(jì)數(shù)板),離心管(nunc,15ml,無菌),吸管(一次性單包裝無菌,碧云天),酒精棉球,75%酒精1瓶,口罩,帽子,手套,mark筆,離心機(jī),超凈臺(tái),培養(yǎng)箱,磁力攪拌器(可控溫),水浴鍋,消化水浴杯(內(nèi)有300ml雙蒸水),臥式染色缸1套(取心用),自制小支架2個(gè)(墊平皿用)。
(值得注意的是我所用的裝培養(yǎng)基的瓶子都是藍(lán)色絲口瓶,這種瓶子瓶口大,相對(duì)來說不容易污染。)

關(guān)鍵詞:多次消化,病從口入

步驟:

一、準(zhǔn)備
1.  帶口罩、帽子,洗手,入培養(yǎng)室
2.  酒精棉球擦拭超凈臺(tái)后,放高壓包123和離心管、吸管、酒精棉球缸于超凈臺(tái)內(nèi);
3.  放75%酒精1臥式染色缸一套(打開蓋)、mark筆于超凈臺(tái)外,放消化水浴杯于磁力攪拌器上(開機(jī),溫度37度,轉(zhuǎn)速小于100)在超凈臺(tái)外;
4.  放15%完全培養(yǎng)基和消化酶于水浴鍋內(nèi)(開機(jī),溫度37度)
5.  開超凈臺(tái)和培養(yǎng)室紫外30min。

二、30min后
1.帶手套,洗凈滑石粉,烘干后入培養(yǎng)室,關(guān)紫外,開超凈臺(tái)風(fēng)機(jī),酒精擦手。
2.取4度不完全培養(yǎng)基置于超凈臺(tái)上,取平皿分為兩個(gè),每個(gè)里面各放一套器械,然后各加不完全培養(yǎng)基8ml,取100ml燒杯一個(gè)。將100ml燒杯和其中一個(gè)平皿放在超凈臺(tái)外的桌子上,100ml燒杯中倒入75%酒精。
3.拿鑷子夾乳鼠,在燒杯中浸泡5-10秒,然后置于殺鼠臺(tái)上(就是臥式染色缸的蓋子),剪刀撕開皮膚,開胸(注意不要損傷消化道),除心包,擠壓后取心,直接取心室肌,置于裝有4度不完全培養(yǎng)基的平皿中。以此類推,直至全部取完。
4.只將有心肌的平皿放回超凈臺(tái),酒精擦手。
5.用第2套剪刀先略微剪一下,基本上把每個(gè)心臟剪成兩半,目的在于先跑跑血。然后,小心移入另一個(gè)平皿,簡(jiǎn)單沖洗后,留下少許液體,猛剪,直到您滿意為止。然后再用不完全培養(yǎng)基洗三遍。用吸管移植消化用錐形瓶。
6.加入消化酶10ml,水浴杯內(nèi)消化10-15min,**次棄上清;剩余組織中再次加入混合酶繼續(xù)磁力消化,靜置后將上清液移入含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基的離心管終止消化,4℃保存;剩余組織用同樣方法反復(fù)消化,直至消化完全。1 200 r/min離心10 min,棄上清,用培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,接種于25 cm培養(yǎng)瓶
7. 37度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h,吸出細(xì)胞懸液離心,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為1-5×106個(gè)/ml后接種于培養(yǎng)瓶和鋪有爬片的6孔板。
8. 24h后觀察,期間不要看細(xì)胞。24h即可見同步搏動(dòng)了。

三、收拾培養(yǎng)室,寫實(shí)驗(yàn)記錄。


(拜力生物 GIBCO血清  )