1、為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代?
體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長(zhǎng)接觸抑制的特性，也就是說當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會(huì)停止生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)器皿的表面時(shí)，正常的細(xì)胞停止生長(zhǎng)，但是轉(zhuǎn)化(即發(fā)生遺傳物質(zhì)突變)的對(duì)接觸抑制不敏感的細(xì)胞會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)。如果不及時(shí)傳代，這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞就會(huì)逐步取代正常的細(xì)胞。
2、為什么大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)需要用二氧化碳培養(yǎng)箱?
一般細(xì)胞培養(yǎng)液的pH在7.0-7.4之間。由于碳酸鹽pH緩沖系統(tǒng)是一種生理pH緩沖系統(tǒng)(它是人體血液中*重要的pH緩沖系統(tǒng))，大多數(shù)培養(yǎng)液用它來(lái)保持穩(wěn)定的pH。用粉末配制培養(yǎng)液時(shí)，常常需要加入一定量的碳酸氫鈉。
對(duì)大多數(shù)以碳酸鹽作為pH緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)液而言，以為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)箱中的二氧化碳需要維持在2-10%之間，以保持培養(yǎng)液中溶解的二氧化碳的濃度。同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)的器皿需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。
是不是采用其他pH緩沖系統(tǒng)就不需要二氧化碳培養(yǎng)箱了呢?人們發(fā)現(xiàn)由于空氣中的二氧化碳濃度很低，如果細(xì)胞不在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中的HCO3-會(huì)被耗盡，這樣會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。所以大部分動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，還是需要二氧化碳培養(yǎng)箱。
細(xì)胞培養(yǎng)液中常附加其他的pH緩沖系統(tǒng)，比如HEPES緩沖系統(tǒng)，來(lái)增加pH緩沖能力。HEPES在pH7.2-7.4之間有很強(qiáng)的緩沖能力，當(dāng)透氣的培養(yǎng)器皿被拿到二氧化碳培養(yǎng)箱外面的時(shí)候，由于空氣中二氧化碳濃度很低，培養(yǎng)液中碳酸鹽緩沖系統(tǒng)就會(huì)失去效果，這時(shí)候HEPES緩沖系統(tǒng)就能繼續(xù)保持pH的穩(wěn)定。
3、怎樣查到一個(gè)特定細(xì)胞株的相關(guān)知識(shí)和培養(yǎng)條件?
ATCC(American Type Culture Collection) 收集了絕大多數(shù)細(xì)胞的詳細(xì)資料。打開ATCC網(wǎng)頁(yè)的Cellsand hybridomas鏈接，輸入細(xì)胞名稱就可以搜索ATCC的細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)。
數(shù)據(jù)庫(kù)中有每一種細(xì)胞的詳細(xì)描述，包括細(xì)胞的來(lái)源，培養(yǎng)和凍存條件，以及相關(guān)文獻(xiàn)等資料。
4、二氧化碳培養(yǎng)箱的挑選和使用
由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液一般使用碳酸鹽pH緩沖系統(tǒng)，要求培養(yǎng)環(huán)境中維持一定濃度的CO2，所以動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)一般需要CO2培養(yǎng)箱。
CO2培養(yǎng)箱采用兩種不同的CO2維持系統(tǒng)。一種方式是通過使用空氣泵，將CO2和空氣按一定比例混合后吹入培養(yǎng)箱。另一種方式是通過一個(gè)自動(dòng)的CO2檢測(cè)控制系統(tǒng)，在檢測(cè)到CO2濃度低于要求濃度時(shí)打開CO2氣閥充入CO2。由于前一種方法耗費(fèi)CO2而且不容易**控制CO2濃度，先進(jìn)的CO2培養(yǎng)箱都采用自動(dòng)監(jiān)控系統(tǒng)來(lái)維持CO2的濃度。
配有自動(dòng)CO2檢測(cè)控制系統(tǒng)的培養(yǎng)箱需要根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明，定期做CO2濃度的測(cè)試和矯正。
CO2培養(yǎng)箱的隔熱采用水套式和氣套式兩種類型。水套式需要用戶在安裝培養(yǎng)箱時(shí)培養(yǎng)箱壁的空間內(nèi)灌入大量蒸餾水。由于水的比熱容很高，水套式的優(yōu)點(diǎn)是有助于均勻散熱和避免形成冷區(qū)，以及在斷電后能夠比較好的減緩培養(yǎng)箱內(nèi)溫度的降低。它的缺點(diǎn)是由于灌入大量的水，培養(yǎng)箱變得非常沉重，不易搬動(dòng)。有效的隔熱系統(tǒng)和先進(jìn)的表面散熱元件的使用使氣套式培養(yǎng)箱兼?zhèn)淞溯p便性和水套式培養(yǎng)箱的優(yōu)點(diǎn)，所以新型的CO2培養(yǎng)箱大多采用氣套式。
目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都使用進(jìn)口的細(xì)胞培養(yǎng)箱。雖然進(jìn)口的產(chǎn)品質(zhì)量上比較有保障，但價(jià)格很貴，而且售后服務(wù)不是很方便。國(guó)內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)箱的質(zhì)量也有了很大的提高，
CO2培養(yǎng)箱一般配一個(gè)水盤，用以維持很高的濕度。水盤內(nèi)的水要定期添加，水盤也要定期清洗以避免微生物的生長(zhǎng)。
為了減少微生物的污染，有一些CO2培養(yǎng)箱提供**功能。有的可以加熱到比較高的溫度來(lái)**，有的則通過讓空氣循環(huán)通過一個(gè)紫外線腔體的辦法來(lái)**，這樣就**時(shí)就不需要中斷細(xì)胞的培養(yǎng)。
5、超凈臺(tái)的挑選和使用
為了避免污染，一般的細(xì)胞培養(yǎng)需要在超凈臺(tái)上進(jìn)行。用于細(xì)胞培養(yǎng)的超凈臺(tái)的潔凈度一般為100級(jí)，即每立方英尺中大于0.5um的顆粒數(shù)量少于100顆，與計(jì)算機(jī)硬盤的生產(chǎn)環(huán)境要求相當(dāng)。
在超凈臺(tái)內(nèi)，過濾后的空氣垂直由上到下，或水平由內(nèi)到外穩(wěn)定的流動(dòng)，從而維持一個(gè)潔凈的操作環(huán)境。根據(jù)氣流的方向，超凈臺(tái)可分為垂直式層流和水平式層流兩種類型。
在水平式層流型超凈臺(tái)內(nèi)，過濾后的空氣由內(nèi)到外流動(dòng)，在操作過程中比垂直式層流型更容易維持一個(gè)潔凈的環(huán)境，減少污染的機(jī)會(huì)。但是由于氣流吹向?qū)嶒?yàn)操作者，增加了實(shí)驗(yàn)操作者感染病原體的機(jī)會(huì)，所以大部分實(shí)驗(yàn)室都采用垂直式層流型的超凈臺(tái)。
在普通的垂直式層流型的超凈臺(tái)內(nèi)，過濾后的空氣自上往下流動(dòng)，通過操作面板前后兩排開孔直接排出。這樣的超凈臺(tái)比較便宜，但是不適合病原體相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作。相關(guān)病原體的操作必須要在生物**柜內(nèi)進(jìn)行。在生物**柜內(nèi)，自上而下的過濾后的空氣經(jīng)過超凈臺(tái)，然后再次過濾后，才被排到外面，從而大大減少了病原體擴(kuò)散的機(jī)會(huì)。當(dāng)然生物**柜比較貴，但考慮到培養(yǎng)的細(xì)胞中以及血清中都有可能有病毒等病原體的存在，有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該盡量使用生物**柜來(lái)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
超凈臺(tái)需要定期檢查，超凈臺(tái)的空氣過濾系統(tǒng)也需要定期更換，以保證超凈臺(tái)內(nèi)的潔凈度?？諝膺^濾系統(tǒng)的更換次數(shù)可以詢問生產(chǎn)廠家。如果有潔凈度檢測(cè)設(shè)備的話，可以非常迅速的檢驗(yàn)超凈臺(tái)的潔凈度。如果懷疑細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染是由于超凈臺(tái)內(nèi)潔凈度降低引起的，可以用將一個(gè)含微生物培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿在超凈臺(tái)內(nèi)敞口放置一段時(shí)間，然后在37℃培養(yǎng)的方法來(lái)評(píng)估。
超凈臺(tái)內(nèi)一般都有紫外線燈用于**。紫外線燈的正確使用方法是在超凈臺(tái)使用前打開半小時(shí)左右。有的操作人員在不使用超凈臺(tái)的時(shí)候把紫外線燈一直打開，這樣不但沒有必要，而且會(huì)大大縮短紫外線燈的使用壽命。紫外線燈要根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明定期更換。
超凈臺(tái)使用完之后要先用蒸餾水擦拭，然后再用70%酒精擦拭。直接用70%酒精擦拭濺在臺(tái)面上的培養(yǎng)液會(huì)在不銹鋼臺(tái)面上留下難以去除的污漬。
6、一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿等標(biāo)明 “TissueCulture Treated”是什么意思?
大部分動(dòng)物細(xì)胞需要貼附在一個(gè)固相界面上才能生長(zhǎng)。而只有親水的固相界面，細(xì)胞才能貼附。
*早的細(xì)胞培養(yǎng)器皿是由玻璃制作的。由于玻璃的表面是親水的，不經(jīng)過特殊的處理，普通的細(xì)胞就可以貼附生長(zhǎng)。
聚苯乙烯透光性能好，具有較好的強(qiáng)度和易塑性，并且沒有毒性，成為一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等一次性細(xì)胞培養(yǎng)耗材的**材料(一般的磁帶和CD盒也是用聚苯乙烯制成的)。然而聚苯乙烯表面是憎水的，所以需要經(jīng)過表面的改性處理，變成親水后才能適用于細(xì)胞培養(yǎng)。
一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿等標(biāo)明“Tissue culturetreated”，是表示該器皿經(jīng)過表面的改性處理，適合貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。而懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，就不一定需要這樣經(jīng)過特殊處理過的器皿。但經(jīng)過表面的改性處理后的細(xì)胞培養(yǎng)皿等一般也適合懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。
公安機(jī)關(guān)備案號(hào)：
